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域结合到siRNA 的3’的二核苷酸突出端;一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。PAZ和PIWI两个结构域,对于siRNA和目标mRNA相互作用,从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程,是必不可少的。同时,不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。例如,在人当中,AGO2“筹划”了RISCs对于目标mRNA的切割过程;而AGO1 和AGO3则不具备这个功能。
Core RISC:是介导目标mRNA切割过程或者翻译抑制的最小的RNA-蛋白质复合物。在人和果蝇身上发现的分子量少于200kDa的RISCs可能就是core RISC的重要代表。AGO蛋白质和Core RISC密切相关。
Dicer (DCR):是RNAase Ⅲ家族中的一员,主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地,我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域,最先在果蝇中发现,并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。
Holo RISC:是在果蝇中发现的有着RISC活性的最大的RNA-蛋白质复合物(80S)。Holo RISC的生物学活性牵涉到几乎所有的RISC的成员,RLC成员,和一些其他通路上的蛋白质分子。Holo RISC的存在,表明了RISC组装不是孤立的,同时还是一个有序的过程。以RISC为中心的RNAi和miRNA通路与一些其他的通路密切联系,很可能借此调控生物体的生长发育过程。
Microprocessor:一种核内的复合物,主要由Drosha和Pasha两者组成,在miRNA的生物合成中促使原始的miRNA成为miRNA前体。
MicroRNA (miRNA):是含有茎环结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(~21-23个核苷酸)。MiRNA,以及miRISCs(RNA-蛋白质复合物)在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能,miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。
RISC loading complex (RLC):是一种促使RISC形成的复合物。RLC有方向性地调节小RNA双螺旋,为以后的RISC组装作好铺垫。siRISC loading complexes (siRLCs)在果蝇中研究最多。有研究者认为在果蝇中的siRLCs包含DCR2-R2D2异型二聚体和siRNA双螺旋;R2D2部分是非对称性的感受器,为RISC组装调整好siRNA的方向。miRISC loading complexes (miRLCs)的研究尚未报导,因为它的过程更为复杂,而且体外研究miRLCs的方法还没有建立。
RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing (RITS):是一种组织染色质变型的复合物。RITS复合物也包含Dicer加工形成的siRNA和AGO蛋白质,通过结合到异染色质的基因池上来促使异染色质上基因的沉默。
RNA-induced silencing complex (RISC):一种RNA-蛋白质复合物,通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SiRNA组装siRISC,miRNA组装miRISC。RISCs(无论siRISC还是miRISC)包括两种类型:切割型和不切割型。研究表明,RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。
Slicer:在切割型RISC中的内切酶的另外一种表述方法。
Small interfering RNA (siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。向左转|向右转
请有经验的战友指点,若可以最好能提供几篇应用动物进行RNA干扰研究的文章.
非常感谢!
在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3 类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统 。
将EntransterTM-invivo与AmbioninvivosiRNA(作用于凝血因子VII)和阴性siRNA通过尾静脉注射成年小鼠,2天后,取动物肝脏检测。在mRNA水平和蛋白水平观察干扰效果。见上图,图中最左侧组为对照组注射阴性siRNA为3mg/kg,后边3组为每kg动物注射阳性siRNA量分别为1mg/kg,2mg/kg和3mg/kg情况。
根据推荐用量注射EntransterTM-invivo和siRNA(作用于LaminA/C)和阴性siRNA到成年小鼠。注射后2天收集相应的组织,分离RNA,用qRT-PCR分析LaminA/C基因的表达水平。图4为尾静脉结果,图5为各器官分别局部注射结果。
英格恩生物体内转染试剂,3天可完成动物体内转染实验,让动物干扰,基因敲除实验变得简单、快速有效!
当然,如果考虑成本这块的话,义翘sinofection可以考虑哦~
http://www.addgene.org/crispr/guide/
两方面的证据提示转座子活性的抑制与siRNA有关
① 发现蠕虫mut-7 基因参与RNAi 并且与转座子的转座抑制有关;
② 在果蝇中, 参与RNAi 的RNA 解螺旋酶Spindle-E 的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失, 同时提高了反转录转座子活性。 RNAi抵御病毒感染
在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现, sgs2/sde1基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性 。 RNAi参与异染色质的形成和维持
Hall 等研究表明,着丝粒同源重复序列和RNAi 组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核;Vople 等在敲除裂殖酵母( S. pombe) 的RNAi 途径基因( 如Argonaute 、Dicer 、RDRP) 时发现异染色质转录得到的dsRNA可以在RNAi 途径的参与下, 加工成si RNA,si RNA 募集异染色质蛋白1( HP1) , 然后靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。 RNAi参与机体的发育调控及生理代谢
RNAi 只抑制转录后的基因, 所以RNAi 在生物体发育学研究中具有优势。Chuang 等用RNAi 技术进一步证实了AG、CLV3 、AP1 、PAN 等已知功能基因在拟南芥花发育过程中的功能。在RNAi 过程中形成的RISC 复合物可根据不同情况分别利用si RNA 或stRNA 行使不同的功能, 但最终均导致特定基因沉默。向左转|向右转
各位同仁大家好,最近在尝试利用CRISPR/cas9技术敲除基因,苦于手里头资源有限,只有lentiCRISPRv2以及相应的包装体系,没有pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0,无奈公司货期较久,想立刻开展实验,不知哪位同仁有此质粒并愿意交换,不甚感激。
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近年来,CRISPR/Cas9风暴席卷全球。这项基因组编辑技术在短短几年内迅速应用于世界各地的实验室,并催生了上千篇文章的发表。然而,麻省理工学院(MIT)的《Technology Review》杂志提出了一个问题,谁才是CRISPR技术的所有者?生物通 www.ebiotrade.com
一个月前,“科学突破奖”(Breakthrough Prize)揭晓。加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和德国亥姆霍兹传染研究中心的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR技术方面的重要贡献而获奖,且每人获得了300万美元的奖金。
这一领域的另一位风云人物,Broad研究院的张锋(Feng Zhang)虽然没有获得科学突破奖,但在今年4月获得了CRISPR/Cas9的首个专利。他的研究中心控制着这一技术的每个重要商业应用。生物通 www.ebiotrade.com
那么问题来了,这个备受瞩目的奖项和专利为何会落入不同人的手中?究竟是谁发明了它?“这一领域的知识产权相当复杂,”CRISPR Therapeutics公司的CEO Rodger Novak谈道。Emmanuelle Charpentier是这家公司的创始人之一。
Tech Review的记者Antonio Regalado指出,张锋与Doudna共同创立了Editas Medicine公司,它获得了Broad的技术授权。不过,在张锋成功申请专利之后,Doudna就与该公司断绝了关系。她将她的知识产权(专利申请中)授予了另一家竞争性的公司Intellia Therapeutics。然而,让事情更加复杂的是,Charpentier又将她在同一专利申请中的权利出售给了CRISPR Therapeutics。生物通 www.ebiotrade.com
此外,围绕这一技术的科学信用,那也是错综复杂。2012年夏天,Doudna、Charpentier及她们的团队发表了一篇文章,证明CRISPR/Cas9系统可以作为一种可编程的DNA编辑工具。半年后,张锋博士以及哈佛大学的George Church发表文章称它可应用于人类细胞,不久后,Doudna也发表了类似的结果。
但是,张锋表示他对Doudna和Charpentier的工作知之甚少。为了支持他的专利申请,他提交了实验室笔记本的照片,表示他在2012年年初就开始了这方面的研究,早于Doudna和Charpentier。生物通 www.ebiotrade.com
Charpentier表示:“我可以说的是,我和Jennifer Doudna是在我的实验室中开展研究。这里的一切都很夸张,因为这是一项人们很容易学会的技术。事情发生得太快了。”
Regalado在文中写道:“目前还没有CRISPR药物。但是如果CRISPR真的如科学家想象得那么重要,对这一基本技术的商业控制将价值数十亿美元。”也许,这场专利之战才刚刚开始。(生物通 薄荷)

