Monoclonal Antibodies
All antibodies are purified on a Protein A column (Ey et al., 1978)1 using the low-salt method.
The antibodies are supplied at a concentration requiring ~1:1000 dilution for Western blotting. All antibodies are stored in Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2. Store at -20°C. (stable for at least 12 months undiluted).
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7F11 Gyr A
This is an IgG2b monoclonal antibody raised against the N-terminal domain of E. coli Gyr A produced from tissue culture supernatant derived from mouse hybridoma cells.
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4D3 Gyr A
This is an IgG2b monoclonal antibody raised against the C-terminal domain of E. coli Gyr A produced from tissue culture supernatant derived from mouse hybridoma cells.
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9G8 Gyr B
This is an IgG2a monoclonal antibody raised against the C-terminal domain of E. coli Gyr B produced from tissue culture supernatant derived from mouse hybridoma cells.
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7D3 Gyr B
This is an IgG2a monoclonal antibody raised against the N-terminal domain of E. coli Gyr B produced from tissue culture supernatant derived from mouse hybridoma cells.
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References
- Ey, P.L., S.J., & Jenkin, C.R. (1978). Isolation of pure IgG1, IgG2a, and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using Protein A sepharose. Immunochemistry. 15: 429-436
- Harlow, E. & Lane, D (1988). Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory press. Cold Spring Harbor
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基因敲除指利用染色体间基因打靶的原理，通过将设计好的打靶载体导入细胞后，同源臂发生同源重组，从而在基因组的某个特定位点引入预定的突变，获得基因型发生了改变的动物。可以分为基因敲入和基因敲出：基因敲入即引入新的基因或突变；基因敲出即使某个特定的基因得到破坏，可以用于研究基因的功能。
转录抑制
与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。
转录后抑制
不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。
翻译抑制
Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。
质粒转染一般是说DNA转染，用常用的sinofection等转染试剂就可以；
小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，这种RNA的转染需要用专门的RNA转染试剂。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。向左转|向右转
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作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。向左转|向右转
近期，上海公卫临床研究中心的一位研究生应用两种转染试剂Turbofecttransfectionreagent（Thermo）和EntransterTM-R4000（Engreen）进行了一次RNA转染比较。比较情况如下：
实验方法
转染试剂：Turbofecttransfectionreagent（Thermo）和EntransterTM-R4000（EngreenBiosystemCo,Ltd）
待处理细胞：humanCD8+T细胞
1.针对Turbofect转染的方法
每孔培养体积均为100μL，细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir，加入9.5μL无血清RPMI1640，充分混匀；
取0.2μLTurbofecttransfectionreagent和agomir稀释液充分混合。
转染复合物制备完成；混匀后室温下孵育15-20分钟，直接取10μL加入已铺好细胞的孔中，继续培养24h收取细胞，用PBS洗涤3次以上，以备RNA抽提。
转染Mix的配制：100nMago/N.C.：（0.5μLagomir+0.2μLTurbofect+9.3μL无血清的RPMI1640）×2.5=1.25+0.5+23.25
2.EntransterTM-R4000转染
每孔培养体积均为100μL，细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir，加入9.5μL无血清RPMI1640，充分混匀，制成10μLagomir稀释液；
取0.25μLEntransterTM-R4000，然后加入9.75μL无血清稀释液体，充分混匀，制成10μLEntransterTM-R4000稀释液；
将EntransterTM-R4000稀释液和agomir稀释液充分混合（可用振荡器或加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。
转染复合物制备完成；
将20μL转染复合物加入孔中的细胞悬液中，前后移动培养皿，混合均匀；
转染后6h观察细胞状态，并更换培养基，继续培养24h后收取细胞，用PBS洗涤3次以上，以备RNA抽提。
转染Mix的配制：100nMago/N.C.：（0.5μLagomir+9.5μL无血清的RPMI1640）×2.5=1.25+23.75；Etranster稀释液：（0.25μLEtranster+9.75μL无血清的RPMI1640）×5=1.25+48.75（室温静置5分钟），取20μL至ago和N.C.管中，室温静置15分钟。
实验结果
结论：从目的miRNA表达水平的检测结果来看，转染24h后，英格恩生物公司（EngreenBiosystem）的EntransterTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。
讨论：从实验结果来看，英格恩生物公司（EngreenBiosystem）的EntranstenTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。EntransterTM-R4000是英格恩生物（EngreenBiosystem）最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA，而且针对mRNA等长链RNA优化。该试剂可将RNA导入多种细胞系，包括原代细胞和悬浮细胞。无论有无血清、抗生素存在均可获得很高的转染效率。
各位同仁大家好，最近在尝试利用CRISPR/cas9技术敲除基因，苦于手里头资源有限，只有lentiCRISPRv2以及相应的包装体系，没有pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0，无奈公司货期较久，想立刻开展实验，不知哪位同仁有此质粒并愿意交换，不甚感激。
