| Product Name | Neuropeptide Y, human, ratYPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY - NH2 |
| Size | 1 mg |
| Catalog # | AS-22465 |
| US$ | $186 |
| Purity | % Peak Area By HPLC ≥ 95% |
| Detailed Information | |
| Storage | -20°C |
| References | Ref: Minth, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4577 (1984). |
| Molecular Weight | 4271.8 |
| YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY-NH2 | |
| Sequence(Three-Letter Code) | H - Tyr - Pro - Ser - Lys - Pro - Asp - Asn - Pro - Gly - Glu - Asp - Ala - Pro - Ala - Glu - Asp - Met - Ala - Arg - Tyr - Tyr - Ser - Ala - Leu - Arg - His - Tyr - Ile - Asn - Leu - Ile - Thr - Arg - Gln - Arg - Tyr - NH2 |
| Product Citations | Shrivastava, A. et al. (2013). Heterobivalent dual-target probe for targeting GRP and Y1 receptors on tumor cells. Bioorg Med Chem Lett 23, 687. doi: 10.1016/j.bmcl.2012.11.110.Pelz, KM. & J. Dark (2007). ICV NPY Y1 receptor agonist but not Y5 agonist induces torpor-like hypothermia in cold-acclimated Siberian hamsters. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol 292, R2299.Gao, J. et al. (2004). Selective activation of central NPY Y1 vs. Y5 receptor elicits hyperinsulinemia via distinct mechanisms. Am J Physiol Endocrinol Metab 287, E706. doi: 10.1152/ajpendo.00530.2003.Kapoor, JR. and CD. Sladek. (2001). Substance P and NPY differentially potentiate ATP and adrenergic stimulated vasopressin and oxytocin release. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 280, R69. |
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年,发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵;08年,发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白(参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体,发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点:
构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点:
严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶(前两代分别是ZFN和TALEN),用于复杂基因组的编辑,目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶,在DNA的特定位置制造单链切口,这样不会引起非同源末端连接,但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面:
基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除
—DNA转染试剂Polyjet-适用于普遍的哺乳动物细胞
LipoD293-适用于悬浮细胞的转染(包括昆虫细胞SF9)-对于普遍的哺乳动物细胞具有更优异的转染效率
—DNAandsiRNA转染试剂
Lipojet-适用于大多数哺乳动物细胞的转染-低毒性(无需换液)-用量少-DNA/RNA共转染(co-transfection)-效果优于Lipofectamine2000
—siRNA转染试剂
GenMute-适用于大多数哺乳动物细胞转染-低毒性(无需换液)-用量少-DNA/siRNA共转染(co-transfection)PepMute-适用于普遍的哺乳动物细胞的转染
转染技术的要点及转染试剂正确选择
转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,它是研究基因表达调控,突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起,其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-96小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
转染效率收多种因素影响,主要因素有下面几个:
1.细胞培养物
健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基,血清和添加物。低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能。一定要避免细菌,支原体或真菌的污染。
2.血清
大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清(FCS)经常用到,便宜一点的有马或牛血清。通常的,血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右)试出对细胞生长良好的血清批号,转染时用同一批号的血清,并同时做负对照(不加转染试剂及外源DNA)以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低,因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤,甚至死亡导致转染效率极低。
3.载体构建
转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。
4.DNA质量
DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国Qiagen公司提供的超纯质粒抽提试剂盒,能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果,使您不必为DNA质量操心。此外,对一些内毒素敏感的细胞(如原代细胞,悬浮细胞和造血细胞),QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒,在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子,保证理想的转染效果。
5.转染技术
转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下:
转染方法原理应用特点
DEAE-右旋糖苷法
带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染不适用于原代细胞,操作简便但重复性差,有些细胞不适用。
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染,瞬时性转染,所有细胞适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件
阳离子性的脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染
瞬时性转染,所有细胞适用性广,转染效率高,重复性好但转染时需除血清
转染效果随细胞类型变化大
病毒介导法
逆转录病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大
细胞需处分裂期,需考虑安全因素,腺病毒瞬时转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞,需考虑安全因素。
Biolistic颗粒传递法
将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达瞬时性转染可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染,瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。
域结合到siRNA 的3’的二核苷酸突出端;一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。PAZ和PIWI两个结构域,对于siRNA和目标mRNA相互作用,从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程,是必不可少的。同时,不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。例如,在人当中,AGO2“筹划”了RISCs对于目标mRNA的切割过程;而AGO1 和AGO3则不具备这个功能。
Core RISC:是介导目标mRNA切割过程或者翻译抑制的最小的RNA-蛋白质复合物。在人和果蝇身上发现的分子量少于200kDa的RISCs可能就是core RISC的重要代表。AGO蛋白质和Core RISC密切相关。
Dicer (DCR):是RNAase Ⅲ家族中的一员,主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地,我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域,最先在果蝇中发现,并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。
Holo RISC:是在果蝇中发现的有着RISC活性的最大的RNA-蛋白质复合物(80S)。Holo RISC的生物学活性牵涉到几乎所有的RISC的成员,RLC成员,和一些其他通路上的蛋白质分子。Holo RISC的存在,表明了RISC组装不是孤立的,同时还是一个有序的过程。以RISC为中心的RNAi和miRNA通路与一些其他的通路密切联系,很可能借此调控生物体的生长发育过程。
Microprocessor:一种核内的复合物,主要由Drosha和Pasha两者组成,在miRNA的生物合成中促使原始的miRNA成为miRNA前体。
MicroRNA (miRNA):是含有茎环结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(~21-23个核苷酸)。MiRNA,以及miRISCs(RNA-蛋白质复合物)在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能,miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。
RISC loading complex (RLC):是一种促使RISC形成的复合物。RLC有方向性地调节小RNA双螺旋,为以后的RISC组装作好铺垫。siRISC loading complexes (siRLCs)在果蝇中研究最多。有研究者认为在果蝇中的siRLCs包含DCR2-R2D2异型二聚体和siRNA双螺旋;R2D2部分是非对称性的感受器,为RISC组装调整好siRNA的方向。miRISC loading complexes (miRLCs)的研究尚未报导,因为它的过程更为复杂,而且体外研究miRLCs的方法还没有建立。
RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing (RITS):是一种组织染色质变型的复合物。RITS复合物也包含Dicer加工形成的siRNA和AGO蛋白质,通过结合到异染色质的基因池上来促使异染色质上基因的沉默。
RNA-induced silencing complex (RISC):一种RNA-蛋白质复合物,通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SiRNA组装siRISC,miRNA组装miRISC。RISCs(无论siRISC还是miRISC)包括两种类型:切割型和不切割型。研究表明,RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。
Slicer:在切割型RISC中的内切酶的另外一种表述方法。
Small interfering RNA (siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。向左转|向右转
大家好,我是CRISPR新手。在设计一个白蛋白基因相关的sgRNA,但是白蛋白的序列有17多kb,很多设计工具都无法导入。请问大家我这个问题该怎么解决呀??
当然,如果考虑成本这块的话,义翘sinofection可以考虑哦~
基因敲除指利用染色体间基因打靶的原理,通过将设计好的打靶载体导入细胞后,同源臂发生同源重组,从而在基因组的某个特定位点引入预定的突变,获得基因型发生了改变的动物。可以分为基因敲入和基因敲出:基因敲入即引入新的基因或突变;基因敲出即使某个特定的基因得到破坏,可以用于研究基因的功能。
EntransterTM-R4000是英格恩生物(EngreenBiosystem)最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA,而且针对mRNA等长链RNA优化。由于纳米技术的应用,EntransterTM-R4000能做到高达90%的转染效率和60-90%的沉默效率,对难转染细胞和原代细胞也非常适用。
先附上一篇英格恩生物RNA转染试剂转染mir-346至Jurkat细胞研究甲状腺的文献,以供参考。
RNA转染试剂转染Mir-346至Jurkat细胞研究甲状腺.pdf(5947.72k)

