mRNA的提取及纯化实验——磁珠法
| 实验材料 | mRNA 试剂、试剂盒 | mRNA分离试剂盒异丙醇NaAC 仪器、耗材 | 仪器水浴离心机取液器分光光度计 实验步骤 | 一、生物素标记的Oligo（dT）探针与mRNA的煺火 1. 在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。 2. 65℃加热10min。 3. 加入2μl生物素标记的Oligo（dT）探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀，室温放置，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。 二、亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗 1. 将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则（约30秒），小心去除上清（不用离心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，漂洗3次。 2. 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。杂交体的生成及漂洗。 3. 将上步“3”中褪火的生物素标记的Oligo（dT）探针，全部加到上步“5”管中，轻轻混匀，室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次。 4. 用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。 5. 用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。 三、洗涤收集mRNA 1. 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。 2. 用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并（约0.25ml） 3. 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12000g离心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。 4. 提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280nm比色，要求A. OD260%/OD280%不小于2.0及40μg所提样品在OD260%的值为1。 5. 提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。 |
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发布于 ： 2021-07-21
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