一材料与设备

1.鲜血中RNA提取

1)磷酸盐缓冲液(PBS)

2)淋巴细胞分离液

3)RNAzolB(Biogencsis,UK）

4)氯仿

5)异丙醇

7)乙醇

8)5mol/L氯化钠

9）DFPC处理的水

10）10ml离心管

2.冰冻血液中RNA提取

1)1.5X溶液D:6mol/L硫氰酸胍，37.5mmol/L柠檬酸钠pH7.0,0.75%十二烷基肌氨酸钠H0.15mol/L2-巯基乙醇

2)酚：氯仿（5:I，pH约4.0)

3)4,2mol/L乙酸钠pH4-0.

4)异丙醇。

5)乙醇。

6)30ml离心管


二操作方法

1.鲜血中RNA提取

1)在20ml无菌管中.用磷酸盐缓冲液稀释抗凝全血(2:l)10mL

2)小心将10ml稀释的血液加人离心管中，管中含有3m]淋巴细胞分离液。确保血液和分离液冇十分明显的界面.二者间应极少或没有混合。

3）室温下400g离心30〜40min，或800g离心15min

4)离心后获得澄清的溶液，聚集的红细胞沉到管底，单核细胞包括淋巴细胞形成明显的云样带位于上层血浆相和下层淋巴细胞分离液的界面。用吸头将单核细胞层移至另一离心管中。

5)加入1XPBS至混合均句，如步骤3离心。

6)去掉上层溶液.在该状态下，淋巴细胞可在-20℃储存几天。

7)加人0.RMAzolB裂解细胞，反复用吸头吹打，以充分吹打以溶解细胞。

8)移人另一无菌Eppendorf管中，加入50u1氯仿，剧烈振荡15s，4℃或冰上孵育5min，样本可在该状态保持1〜2h

9)12000g离心15min

10)将上层水相移至一个新的Eppendorf管，小心避免与中间相混合，该中间相含DNA和蛋白质。加人等体枳异丙醇约400ul,4℃或20℃过夜。

11)12000g高速离心15mim，管底可见:RNA沉淀。

12)移去上清液，加入800ul75%乙醉冼涤RMA沉淀一次，7500g离心8min。

13)加人200ul0.2mol/L氯化钠再溶解RNA。用400ul100%乙醇沉淀RNA，一20℃放置lh

14)12000g高速离心15mm,RNA沉淀用乙醇洗涤同上

15)打开管L1，室温干燥15min

16)加人50〜100ulDEPC处理的水，溶解RNA,为增加溶解度，可在52〜60℃助溶5〜I5min

17)定量分析RNA

2.冰冻血液中R1NA提取

1)水浴加热2ml(或5ml)的冰冻全血

2)标本充分融化后，将其移人无菌的30ml离心管中，内含3ml(或5ml)1.5XD溶液，混合均匀。加人6ml(或1Oml)酚：氯仿（5:1)和0.5ml（或1ml)4.2mol/L乙酸钠，PH4.0,混合均勻，混合时最好用封口膜封口。

3)冰上孵育20mim。

4)5500g，4℃离心30min

5）转移上清液至另一离心管中

6)加人等体积的异内醇，一20℃过夜。

7)5500g离心30min

8)弃上清液，将管倒置2〜3min

9)加入300ul1.5X溶液D溶解沉淀。如需要再加入400ul异丙醇,—20℃放置lh

10)室温下11000g离心lOmin

11)弃上清液，加人750ul75%乙醇洗涤沉淀，11000g离心2min

12)弃上清液，加人50ulDEPC处理水溶解RNA

13)定量分析RNA