ProductDescription
T7RNAPolymerasecatalysesthesynthesisofRNAinthepresenceofdouble-strandedDNAcontainingaT7promotersequence.ItisisolatedfromanE.colitransformedbyaplasmidcontainingtheT7RNAPolymerasegene.Thisenzymeisprovidedinglycerol-basedstoragebuffercontaining:20mMpotassiumphosphatepH7.5,100mMNaCl,1.0mMEDTA,10mMDTT,0.2%TritonX-100and50%glycerol.Alternatively,itisalsoprovidedinthesamebuffercontaining1.0Mtrehaloseinsteadofglycerol(suitableforlyophilization).Concentration70,000units/mL.
Pleaseinquireforcustomconcentrationsandbulkquantities.
Applications:
PreparationoffluorescentorrADIoactivelylabeledRNAprobes
PreparationoflargeRNAtranscriptsforanalysisorinvitrotranslation
AmplificationofRNA(inconjuctionwithAMVRTandRibonucleaseH.)
Preparationofanti-senseRNA
Preparationofribozymes
PreparationofmRNAprecursorforsplicing
PreparationofdsRNAforRNAinterferenceorsilencing
PreparationofsubstrateinRNaseprotectionassays
PreparationoftemplateforgenomicDNAsequencing
PreparationofRNAforstudiesofRNAsecondarystructureandRNA-proteininteractions
Reagentssupplied:
5XReactionBufferforT7RNAPolymerase
1XReactionBufferConditions:
40mMTrisHCl,pH7.7
6mMMgCl2
10mMDTT
2mMSpermidine
Tobesupplementedwith:
0.5mMATP,CTP,GTPandUTP
DNAtemplatewithT7promoter
(20nMofalinearizedplasmidDNAor40ug/mLofa3Kbplasmid)
Incubateat37ºC
UnitDefinition:
Oneunitisdefinedastheamountofenzymethatwillincorporate3nmolofUridinetriphosphateintoacid-insolubleforminonehourat37ºCunderstandardassayconditions:40mMTrisHCl,pH7.5,30mMMgCl2,20mMDTT,0.4mMGTP,CTP,ATP,UTPand[3H]-UTP,20µg/mLnon-linearizedplasmidDNA,50µg/mLBSA.
GeneralNotes:
DithiothreitolisrequiredforT7RNAPolymeraseactivity.ThislABIlecomponentofthereactionbuffermayberestoredbysupplementingreactionswithafinalconcentrationof10mMDTT.
HigheryieldsofRNAmaybeobtainedbyincreasingtheconcentrationofNTP’stoasmuchas4mM.
Caremustbetakenthatthetotalsaltconcentrationinthereactiondoesnotexceed50mM,sincethisenzymeissensitivetosaltconcentrationsexceedingthisamount.
QualityControlofT7RNAPolymerase
1.)DNaseActivity:One-halfµgofHaefragmentsofPhiX-174DNAisincubatedat37ºCwith175unitsofT7RNAPolymerasefor3hours,andthenelectrophoresedinanativeagarosegelsimultaneouslywithcontrolpositiveDNase1reactions.Nomorethantheequivalentof1.25X10E-4unitofDNase1isdetected.
2.)RibonucleaseActivity:OnemicrogramofanRNALadderisincubatedfor2hourswith280unitsofT7RNAPolymerase,andthenelectrophoresedinanativeagarosegelsimultaneouslywithcontrolpositiveRNase1Areactions.Nomorethantheequivalentof8.0X10E-8unitofRNase1Aisdetected.
3.)SpecificActivity:ThespecificactivityoftheT7RNAPolymeraseisnolessthan400,000unitspermg.
References:
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,(2ndEd.),10.27-10.37
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,(2ndEd.),18.82-18.84
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伊立替康是喜树碱的半合成衍生物。喜树碱可特异性地与拓扑异构酶I结合，后者诱导可逆性单链断裂，从而使DNA双链结构解旋；伊立替康及其活性代谢物SN－38可与拓扑异构酶I－DNA复合物结合，从而阻止断裂单链的再连接。现有研究提示，伊立替康的细胞毒作用归因于DNA合成过程中，复制酶与拓扑异构酶I－DNA一伊立替康（或SN－38）三联复合物相互作用，从而引起DNA双链断裂。哺乳动物细胞不能有效地修复这种DNA双链断裂。
毒理研究
遗传毒性：伊立替康和SN－38在Ames试验中均未显示出致突变性。伊立替康在CHO细胞染色体畸变试验和小鼠微核试验中显示了致断裂作用。
生殖毒性：在啮齿动物多次给药试验中，可见雄性动物生殖器官萎缩。雌性大鼠静脉注射14C一伊立替康，其放射性可透过胎盘屏障，大鼠和家兔试验中，可见本品对胚胎和胎儿的毒性反应。大鼠静脉注射放射性标记的伊立替康后5分钟内，可在其乳汁中检测到放射性，给药4小时后乳汁中药物浓度可达到血药浓度的65倍；雌性大鼠在围产期静脉注射本品可引起仔鼠学习能力和雌鼠仔鼠体重的下降。
尚无足够的和严格控制的孕妇临床研究资料，若患者在孕期使用本品或在使用本品期间怀孕，应被告之对胎儿的潜在危害。有生育可能的妇女在本品给药期间应避免怀孕；母亲在接受本品治疗期间应停止哺乳。
致癌性：尚未进行伊立替康长期给药的致癌性研究，但进行了大鼠连续三周、每周一次静脉注射伊立替康2mg/kg和25mg/kg，然后恢复91周的试验（大鼠静脉注射伊立替康25mg/kg后，其Cmax和AUC分别约相当于人每周给药125mg/m2后的7倍和1.3倍）,结果显示，子宫喇叭口处子宫内膜间质息肉和子宫内膜间质肉瘤发生率的增加有明显的剂量依赖性。
【药代动力学】
文献报导，人体静脉注射本品后，伊立替康的血浆浓度呈常指数消除。平均消除半衰期为6～12小时，活性代谢产物SN－3 8的消除半衰期为10～20小时。因为其内酯和羟基酸是化学平衡的，故活性内酯和SN－38的半衰期与完整的伊立替康和SN－38的半衰期相近。
在50～350mg/m2的剂量范围内，伊立替康吸收面积（AUC）与剂量呈线性递增关系：SN－38的AUC增加要小于剂量的增加。在90分钟内静脉滴注本品后1小时内，活性代谢产物SN－38达到最大浓度。伊立替康与血浆蛋白的结合率为 30%～68%，明显低于SN－38与血浆蛋白的结合率（大约95%）。伊立替康主要在肝内由羧酸酯酶转化为活性代谢产物SN－38，后者代谢为葡萄糖甙酸，活性为SN－38的1/50～1/100（由体内细胞毒性检测）。体内分布不明；药物及代谢产物经尿排泄：伊立替康为11%～20%，SN－38<1%，SN－38糖甙约3%。给药48小时后胆汁蓄积和经尿排泄的药25%～50%。
【贮 藏】
遮光，密闭保存。
【包 装】
西林瓶装，1瓶/盒，有40mg及100mg两种规格。
效 期】
24个月
【执行标准】
WS1-（X-166）-2005Z
【生产企业】
企业名称：辉瑞制药；安万特制药；齐鲁制药；江苏恒瑞医药股份有限公司向左转|向右转
最近遇到了实验上的大问题，就是用一步法做RNA的荧光定量PCR时，发现低浓度的做不出来，而DNA是可以的，想请问各位在一步法PCR中有没有什么高见，就是逆转录的Buffer有没有什么需要注意的地方！就是在逆转录酶的最适Buffer和Taq酶的最适Buffer中寻找一个最适的Buffer！
请规范发贴，求助贴请在标题前加【求助】，谢谢您的合作。——by草根
DNA拓扑异构酶Ⅱ与抗肿瘤药物靶点的研究进展.doc(59.5k)
ResponseofskeletalmuscleRNApolymerasesIandIItotumourgrowth
BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-GeneStructureandExpression,Volume950,Issue3,7September1988,Pages296-302
GeorgeA.J.Goodlad,CatherineM.Clark
或者有高手知道怎么测也行
