S. pneumoniae Topoisomerase IV
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S. pneumoniae Topoisomerase IV
Topo IV (from Streptococcus pneumoniae) is prepared by overexpressing the subunits in E. coli and purifying them by methods developed in-house.
The subunits are purified to >95% purity as judged by SDS-PAGE. The topo IV is supplied as a heterotetramer complex in Dilution buffer.
It is recommended that the enzyme is aliquoted to avoid repeated freeze-thaw cycles. Store at -80ºC.
All enzyme is supplied with 5X concentrated Assay Buffer and Dilution buffers which are also available separately.
See technical documents below for more detailed information and lot specific activities.
Technical Documents
S. pneumoniae Topoisomerase IV Relaxation Assay Kits
These contain S. pneumoniae topo IV and the supercoiled DNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for relaxation reactions. 1 U of topo IV will relax 0.5 µg supercoiled pBR322 DNA in 30 minutes at 37°C.
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S. pneumoniae Topoisomerase IV Decatenation Assay Kits
These contain S. pneumoniae topo IV and the catenated kDNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for decatenation reactions. 1 U of topo IV will decatenate 200 ng of kDNA when incubated in 1X Assay buffer in a total reaction volume of 30 µl at 37°C for 30 minutes.
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摘要:随着转基因技术的发展,获取目的基因片段的方法也越来越多样化,获取目的基因片段的技术也日新月异,但是无论获取的方法和手段怎么样发展,获取的主要思路始终在围绕一根主线在开展。
关键词:基因 ,遗传效应,基因克隆,体外重组
一、基因工程
基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。
基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。
基因工程( 又称DNA 重组技术、基因重组技术) , 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。 基因工程研究内容为:
(1) 从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段。
(2) 在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。
(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。
(4) 从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。
第一代热启动Taq酶是一种DNA聚合酶。 第一代指的是直接从Taq(这是一种细菌)体内提取的天然聚合酶,没有进行化学修饰的,为了达到更好的聚合催化效果,往往需要经过酶工程处理,得到的聚合酶催化效率更高。 热启动是指这种酶的反应温度条件
Taq DNA polymerase是从克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后,再经过柱纯化分离出来的一个约94 KD的重组蛋白。无外源核酸酶和细菌DNA污染,稳定性好,特异性强,适用于常规PCR扩增。
DNA水解酶,用于切断磷酸二酯键的酶,这些酶使糖-磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解.一般分为两种:外切核酸酶和内切核酸酶。
简介:
原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
目前常用方法有:化学修饰法、反应动力学法、X-射线衍射法等.1.化学修饰法:此方法是研究最早,应用最广泛的方法.原则上讲,酶分子侧链上的各种基团
近日,国际微生物学权威期刊MolecularMicroBIOLOGy在线发表了上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室由德林教授研究小组的最新研究进展“RegulationofDNAphosphorothioatemodificationsbythetranscriptionalregulatorDptBinSalmonella”。该研究揭示了DNA磷硫酰化修饰在转录水平上调控的分子机制。
DNA磷硫酰化修饰是近年发现的一种新型表观遗传学生理修饰,该修饰位于DNA大分子骨架上,由硫原子取代了DNA磷酸骨架上非桥联氧原子而形成了具有序列特异性和空间构象专一性的磷硫酰化修饰。这种新型表观遗传学修饰的调控机制目前尚不清楚,但该发现拓展了经典的DNA组成理论,在国内外引起了广泛关注。
由德林教授研究小组成秋香和曹博研究发现,敲除沙门氏菌中控制磷硫酰化修饰基因dptBCDE中的dptB基因后,细胞内磷硫酰化修饰水平增强,同时在细胞快速生长时期,该基因的下游DNA磷硫酰化基因转录水平明显增高。当用dptB基因回补其突变株时,下游修饰基因的转录和细胞内磷硫酰化修饰恢复到与野生型沙门氏菌相当水平,表明dptB在转录水平上负调控DNA磷硫酰化修饰基因的表达。同时,通过精确定位DptB在DNA磷硫酰化修饰基因上游调控区的2个DNA结合区域,研究小组发现每个靶序列中都含有1对保守的正向重复序列,进一步研究也表明,这种负调控机制是DNA磷硫酰化修饰中普遍存在的调控方式。
该研究是由德林教授研究小组继破译DNA磷硫酰化修饰基因组图谱(Caoetal,NatureCommunication,2014,5:3951),解析DNA磷硫酰化修饰限制系统作用机制(Caoetal,MolecularMicrobiology2014,93(4):776-85)之后,在这种新型表观遗传学修饰生物学研究上的又一重要进展,对理解基因组上的低频率的修饰机制和修饰的生理功能具有重要的意义。
文章链接:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mmi.13096/pdf

