
T7 RNA Polymerase is a DNA-dependent RNA polymerase that exhibits high specificity for the bacteriophage T7 promoter sequence 5"-TAATACGACTCACTATA-3". The enzyme can incorporate labeled or unlabeled nucleoside triphosphates into an RNA transcript. Large quantities of RNA can be synthesized from a DNA sequence cloned downstreamofthe T7 promoter due to the high processivity and transcription frequency of T7 RNA Polymerase. The enzyme is supplied in a buffer of 20 mM potassium phosphate (pH 7.9), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50% glycerol.
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核酶(ribozyme)是指一类具有催化功能的RNA分子,通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂,特异性地剪切底物RNA分子,从而阻断基因的表达.
核酶的催化功能与其空间结构有密切关系,目前已知有多种特殊结构的核酶:
RNaseP的RNA碱基(M1 RNA)、锤头型、发夹型丁型肝炎病毒RNA、1类内含子和2类内含子,大多有hammerhead structure。
不同的核酶可分为两类:
1 剪切型核酶:只剪不接,如M1 RNA
2 剪接型核酶:该酶具有序列特异的内切核酸酶、RNA连接酶等多种酶活性,如1类和2类内含子向左转|向右转
RNA聚合酶的作用位点:3'-5'-磷酸二酯键
DNA解旋酶的作用位点:DNA中互补碱基之间的氢键
详情:http://www.bioku.cn/201212/science-cirp-circADIan-gene-clip-posttranscriptional-modification-fibroblast/
在哺乳动物组织中,节律基因的表达受到局部的振荡器或视交叉上核中生物钟主钟控制的系统信号的调控。本研究发现是受刺激的体温循环而不是外周振荡器,控制纤维母细胞中的冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的节律性表达。反过来,功能缺失性实验表明CIRP是高振幅的节奏基因表达所需的。利用基于生物素-链亲和素的交联和免疫沉淀反应(CLIP),本研究对CIRP结合的RNA进行了全转录组分析,发现了一些编码昼夜节律振荡器蛋白的转录物,包括CLOCK蛋白。此外,在CIRP缺失的纤维母细胞中,CLOCK的含量大大减少。因为在这些细胞中,CLOCK的异位表达提高了节律基因的表达水平,因此我们猜测CIRP通过调节CLOCK的表达水平赋予了昼夜节奏振荡器的健壮性。
比如用QIAGEN的RNase-free的DNase处理的,不是加了DNase就结束了,为了去除DNase(蛋白)和buffer等可能影响到后期操作的因素,所以酶解了DNA后必须纯化RNA(QIAGEN的纯化柱),这样得到的RNA才用于定量实验。即使这样,在做real-time PCR时都要加一管仅加RNA的作为阴性对照(排除DNA的污染)。
人们已经发现:HIV的Rev蛋白募集细胞转运因子Crm1来转运HIV-1的一些必须mRNA。而宿主mRNA的转运主要依赖另一个转运因子:theTap–Nxt1dimer。另外宿主mRNA的转运还需要另一个的酶——Dbp5的参与。Dbp5是含DEAD-box的解旋酶家族的一个成员。DEAD-box解旋酶利用ATP释放的能量来伸展RNA结构,游离RNA-蛋白质复合体。这个蛋白家族被认为和RNA的每一个步骤都有关系包括:前mRNA的剪切,mRNA的转运,核糖体的组装,mRNA的翻译等。Dbp5首先再酵母中被鉴定发现——积聚的核边缘的胞浆蛋白,对核mRNA的转运是必须的。后来的研究还发现其与核孔复合体(NPCs)有特异的association。最近的实验还发现Dbp5在核和胞浆之间穿梭。
给青蛙卵注射突变的Dbp5(不能利用ATP)可以阻断细胞mRNA的转运,而不影响Rev-Crm1介导的HIV-1的mRNA的转运!这有两种可能性:1,Rev-Crm1介导的mRNA不需要remodelling;2,它依赖其他的解旋酶。
Yedavalli等发现DEAD家族的另一个成员:DDX3,证实了后一种假设。——过表达的DDX3可以特异的增强Rev-Crm1依赖的核mRNA转录;抑制DDX3则相反。且DDX3可以与Crm1和Rev在体内特异的结合。所以作者认为这可能是HIV治疗的又一靶点。但这仍存有疑问:进化中DDX3不可能只为了HIVmRNA的转运而存在,抑制它可能会有不可预测或有害的后果。
cell上Yedavalli等发表的该文章的全文:http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4DN8MNH-9&_coverDate=10%2F29%2F2004&_alid=235528316&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000053666&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1553337&md5=7cf4d401bba6145b024a32f3309cc453
Nature上对该文章的一篇评述:NuclearRNAexportunwound——ThewaysinwhichHIVcansubvertcellularprocessesforitsownendsseemboundless.Thelatestdiscovery—acellularenzymethathelpstoexportHIVRNAfromthenucleus—revealsapossIBLedrugtarget。
真核生物中有3种依赖DNA的RNA聚合酶,即RNA聚合酶I 、II、 III。RNA聚合酶I主要负责转录rRNA,RNA聚合酶II负责催化合成mRNA。
遗传信息从DNA分子转录到RNA分子中的过程称为转录(transcription)。在真核生物中,最初转录生成的RNA称为不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。核内不均一RNA 为存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA(分子量约为105~2×107,沉降系数约为30-100S)之总称。占细胞全部RNA之百分之几,在核内主要存在于核仁的外侧。认为hnRNA多属信使RNA(messenger ribonucleic acid,mRNA)之前体,包括各种基因的转录产物及其成为mRNA前的各中间阶段的分子,在5'末端多附有间隙结构,而3'的末端附有多聚腺苷酸聚合酶分子。这些hn-RNA在受到加工之后,移至细胞质,作为mRNA而发挥其功能。大部分的hnRNA在核内与各种特异的蛋白质形成复合体而存在着。
前信使RNA(英语:Precursor mRNA,简称为前mRNA)是一种未成熟的单链信使核糖核酸(mRNA)。前mRNA是从细胞核中的DNA模板通过转录而合成的。前mRNA构成了不均一核RNA(或称为核内异质RNA或核内不均一RNA,简称为hnRNA)数量上的主体。hnRNA这一术语通常被用作为前mRNA的同义词,尽管,在严格的意义上说,hnRNA可以包含那些并不最终成为胞浆中mRNA的细胞核RNA转录物。一旦前信使RNA被完全加工完成,他就被叫做“成熟信使RNA”、“成熟mRNA”或被称为“mRNA”。真核前信使RNA在其被加工成为mRNA之前仅短暂地存在。前信使RNA包含有两种片段,外显子与内含子。外显子是在最终的mRNA之中被保留下来的片段,然而内含子则在一步称为剪接的过程中被除去,这一步由剪接体实行(自剪接内含子除外)。
对于真核前信使RNA,附加了对5'与3'修饰的追加加工步骤。其中包括了加上7-甲基鸟苷的5'端帽以及多腺苷酸化。此外,由核小核糖核蛋白颗粒组成的剪接体也会切除真核前信使RNA的内含子。
当一条前信使RNA链被正确地加工为一条信使RNA序列时,它被细胞核输出并最终被翻译成为蛋白质,这是一个由核糖体协力完成的过程。
在原核细胞中,剪接是通过自身催化或内分解切割而完成的。并不涉及蛋白质的自身催化切割仅仅保留用作编码rRNA的那部分,而内分解切割针对于tRNA前体。
https://www.nature.com/articles/ni.3830.epdf?referrer_access_token=-Pjl2rt1nZv_1Z8JIoznz9RgN0jAjWel9jnR3ZoTv0PyprITrhfI0J5ucCRfVO-aui0xL-EVR7N2JR4xNKbXmYtj4yXphjh43zAiP6r70OSxNUbkTgT9CKdP6rhb181-RAaL3nGfbbFavHe89R525v6eyOP-tI8-8kcwVAVmKJT1UwT0dPSmOENdZt03DCnok55kvZGMawTEwNU1ehYjDg%3D%3D&tracking_referrer=news.sciencenet.cn
针对DDX家族成员在RNA识别和代谢及其在调控抗病毒天然免疫应答中发挥的重要功能,通过筛选多种DDX家族成员在病毒感染巨噬细胞天然免疫应答中的作用,发现了DDX46能显著抑制病毒感染诱导的干扰素表达
DDX46能结合到抗病毒效应分子mRNA的CCGGUU保守基序上,当病毒感染时DDX46与m6A去甲基化酶ALKBH5结合增加,使得与DDX46结合的抗病毒效应分子mRNA发生去甲基化修饰而导致其核滞留,阻滞了这些抗病毒效应分子的蛋白表达从而降低干扰素产生,最终抑制了抗病毒天然免疫应答反应

