Overview:
p70S6K is responsible for the phosphorylation of 40S ribosomal protein S6 and is ubiquitously expressed in human adult tissues (1). p70S6K is activated by serum stimulation and thisactivation is inhibited by wortmannin and rapamycin. p70S6k activity undergoes changes in the cell cycle and increases 20-fold in G1 cells released from G0 (2). p70S6K activation requires sequential phosphorylations at proline-directed residues in the putative autoinhibitory pseudosubstrate domain, as well as threonine 389 a site phosphorylated by phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK-1).
Gene Aliases:
S6K; PS6K; S6K1; STK14A; RPS6KB1; p70-alpha; p70(S6K)-alpha
Genbank Number:
NM_003161
References:
1.Ferrari, S. et al: S6 phosphorylation and the p70s6k/p85s6k. Crit Rev Biochem Mol Biol. 1994;29(6):385-413. Review.2.Edelmann, HM. Et al: Cell cycle regulation of p70 S6 kinase and p42/p44 mitogen-activated protein kinases in Swiss mouse 3T3 fibroblasts. J Biol Chem. 1996 Jan 12;271(2):963-71.
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产生这一现象的原因在于 DNA合成酶只能沿5'-3'的方向合成DNA 而DNA本身的两条链又是反向分布的 所以就造成了只有一条链合成可以连续地进行下去(以它为模板的子链生成方向正好是DNA聚合酶可以直接提供的) 而后随链要盘绕成回环 反扭过来 才能合成
再合成起始的时候 DNA聚合酶是需要一段RNA引物的 在原核生物中这一引物是由dnaQ(一种酶)在已解旋的单链5'端合成,真核生物中也有对应的酶 由于后随链的合成不连续 所以每个片段都要有引物 在DNA合成结束的时候 这些引物要被切除 因而留下缺口 这时又要特定的酶去填补缺口(比如 大肠杆菌中的DNA聚合酶I)可是填补序列和周围序列间会有缺刻 也就是说他们交界处的3'-5'磷酸二脂键是断开的 这时需要DNA连接酶发挥作用 将其连好
所以 后随链上的缺刻多 还真够DNA连接酶忙一阵的 前导链上只有一开始有RNA引物 因此 最后也基本只有这个地方会用到连接酶
DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键最初从原核生物(大肠杆菌)分离得到的.现在生物基因工程主要是从T4噬菌体中分离得到的,
大家有用过Invitrogen的T4连接酶吗?说明书上是23-26度连接,一般的连接酶不都是16度吗?应该用多少度呢?另外,说明书上还说连接后为了达到更好的转化效率,应将连接反应液至少稀释5倍再转化,是这样吗?谢谢大家帮忙啊
求有经验的大神指教,我的载体和目的基因连不上,转化不到大肠中,比例为1:3。另外,为啥胶回收后的载体浓度那么低,大约6ng/ul了,影响连接么?
有没有人用过NEB的Blunt/TALigaseMasterMix和InstantSticky-endLigaseMasterMix?
有没有人用过NEB的Blunt/TALigaseMasterMix和InstantSticky-endLigaseMasterMix?
有没有人用过NEB的Blunt/TALigaseMasterMix和InstantSticky-endLigaseMasterMix?
.....它说连得又快又好,想问问有木有小白鼠试过它家的这两个产品呢。。如果用过能不能请教下效果咋样呢。。我之前用Thermo的T4,属于又便宜又慢效果还可以的那类型的。。(虽然说thermo也说室温30min就ok,但是还是4度过夜了,室温30min不靠谱)
只不过限制性核苷酸酶是将磷酸二酯键切断;而DNA连接酶则是形成磷酸二酯键。

