紫外可见分光光度计项目采购公告
| 实验材料 | T4DNA连接酶T4多聚核酸激酶RNA供体受体寡核苷酸cDNA模板 试剂、试剂盒 | 10X连接缓冲液[Y32P]ATP无RNase水l0mmolLATPRNasin。无RNase的DNase。5XTBE2X变性胶上样缓冲液TE 仪器、耗材 | 真空离心浓缩仪 实验步骤 | 一材料与设备 1)T4DNA连接酶 2)T4多聚核酸激酶 3)RNA供体 4)受体 5)寡核苷酸cDNA模板 6)10X连接缓冲液：500mmol/LTris-HCl(pH7.5)，100mmol/LMgCl2，200mmol/LDTT,0.5mg/mLBSA(适用NewEngtandBiolabs连接酶）或660mmol/LTris-HCl(pH7.6)，66mmol/LMgCl2,lOOmmol/LDTT(适用于Amersham/USB连接酶） 7)[Y32P]ATP(10mCi/ml,300Ci/mmol=3.33umol/L) 8)无RNase水 9)l0mmol/LATP 10)RNasin。 11)无RNase的DNase。 12)真空离心浓缩仪。 13）5XTBE:54gTris，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0) 14)2X变性胶上样缓冲液：10mol/L尿素，1XTBE或80%甲醛，1XTBE 15)TE；10mmol/LTris-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA 二、操作方法 1.磷酸化3＇RNA 1)在1.5ml管中加入5ul[γ32P]ATP(50ulCi,16pmol)，用真空离心浓缩仪干燥。 2)在此管中加入：0.5ul10X连接缓冲液，3ul20umol/L3＇RNA,1ul水，0.5ulT4多核苷酸激酶,终体积为5.0ul 3)于37℃:孵育30〜60min 4)于75°C孵育l0min或92〜95℃孵育2min,灭活多核苷酸激酶。置于冰上 2.连接反应 1)在灭活的多核苷酸激酶反应管中，加1.0ul10×连接缓冲液.3.0ul20umol/L5＇RNA,3ul20umol/LcDXA模板。 2)加热至75℃2min再室温放置5min,杂交RNA与DNA。 3)在杂交反应液中加入1.l0mmol/L冷ATP，2ulT4DNA连接酶，至终体积15ul 4)于30°C孵育2〜4h。 5)加lul无RNase的DNase,于37℃孵育15〜30min 6)加16ul2X上样缓冲液，上样电泳，可以检测到标记的5＇RNA与3＇RNA以及相成于连接产物的全长分子。 注意事项 | 对于有效的连接，桥梁cDNA模板的浓度非常重要，最好等于或介于两种待连接的RNA分子的浓度之间，如模板过量，RNA分子就会与不同的cDNA模板结合，而无法同另意RNA分子结合。我们建议连接反应中RNA的浓度最好为0.1〜10umol/L |
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发布于 ： 2019-01-11
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