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OptimizedforcloningtoxicorunstableDNA
StABIlizetoxicinsertsincommoncloningandexpressionvectors(pUCandpET-typevectors)- Cloneandmaintainchallengingsequencesatreducedplasmidcopynumber,theninducetohighcopynumberforDNArecovery
- AvoidT1andT5phagecontaminationwithtonAmutation
- Choosechemicallycompetentcellsforgeneralcloningorelectrocompetentcellsfordemandingapplicationssuchaslibrarygeneration
Applications
- CloningofunstableDNAsequencesorthoseexpressingtoxicproteins.
CopyCutter™EPI400™E.coli*cellsweredevelopedtosignificantlylowerthecopynumberofawidevarietyofcommonvectorssothatyoucanmorereADIlycloneunstableDNAsequences.DNAthatisunstableathigh-copynumberoftencodesforaproteinthatinhibitscellgrowthorcontainsAT-andGC-richsequencesorsequenceswithstrongsecondarystructure(Fig.2).1
TheCopyCutterEPI400celllinewasderivedfromEpicentre'shigh-transformationefficiencyphageT1-resistantTransforMAX™EC100™-T1RE.colistrainbymanipulatingagenethatcontrolsthecopynumberofvectorscontainingColE1orpMB1originsofreplication(e.g.,pUC-andpET-typevectors).Thisconstitutivelyexpressedgene,pcnB(plasmidcopynumber),wasdeletedfromtheTransforMAXEC100strainandreplacedwithamodifiedpcnBgenethatislinkedtoaninducIBLepromoter,creatingtheCopyCutterEPI400strain.
ThecopynumberofColE1-typevectorsintheCopyCutterEPI400straincomparedtotheparentalTransforMAXEC100strainisapproximately4-to25-foldlower,dependingonthevector.Moreover,ashortincubationinthepresenceoftheCopyCutterInductionSolutioncanincreasethecopynumberofthevectortoimproveplasmidyields(Fig.3).
Figure1.Copy-numberofColE1-typeplasmidsisloweredupto25-foldinCopyCutter™EPI400™E.colicells.LanesC,TransforMax™EC100™cells;LanesUandI,uninducedorinducedCopyCutterEPI400cells.DNAextractsfromthesamenumberoflysedcells(basedonOD600)wereloadedperlane.
 |  |
| Figure2.DNAinsertsencodingtoxicgeneproductsweresuccessfullyclonedintohigh-copy-numbervectorsusingCopyCutter™EPI400™E.colicells.Aftersequencing,thefull-lengthacpPclonesinTransforMAX™EC100™cellswerefoundtocontainmultiplepointmutations. | Figure3.UninducedCopyCutter™EPI400™E.colicellscontainingaregBclone(laneU)areinducedtohigher-copynumber(laneI)usingtheCopyCutterInductionSolution.CrudeextractsofplasmidDNAwerepreparedfromcellsgrowninselectivemediaandanalyzedbyagarosegelelectrophoresis.Approximatelythesamenumberoflysedcells(basedonA600)wereloadedperlane. |
Benefits
- Maintainclonesatlow-copynumber,theninducetohighercopynumberforimprovedplasmidyield.
- Hightransformationefficiencywithclonesofallsizes.
- tonAforresistancetobacteriophagesT1andT5.
- lacZΔM15forblue/whitescreeningofrecombinants.
- Restrictionminus[mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]genotypeenablesefficientcloningofmethylatedDNA.
- Endonucleaseminus(endA1)toensurehighyieldsofDNA.
- Recombinationminus(recA1)forgreaterstabilityoflargeclonedinserts.
Genotype
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsL(StrR)nupGtrfAtonApcnB4dhfr
CopyCutterEPI400ElectrocompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x1010cfu/µgofpUC19.
CopyCutterEPI400ChemicallyCompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x107cfu/µgofpUC19.
Reference
- Haskins,D.(2004)EpicentreForum11(5),6.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
ORDERINFORMATION
Tentubeseachcontaining50µLofcells(enoughcellsfor10transformations),CopyCutter™InductionSolutionandpUC19controlDNA.TheCopyCutter™InductionSolutionisprovidedata1,000Xconcentrationandisfiltersterilized.蚂蚁淘电商平台
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博仕生物医学服务中心在发布的基因敲除小鼠（gene knock out）供应信息，浏览与基因敲除小鼠（gene knock out）相关的产品或在搜索更多与基因敲除小鼠（gene knock out）相关的内容。 查看更多
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2018-07-08
上海邦耀生物科技有限公司在发布的TALEN技术制备基因敲除小鼠供应信息，浏览与TALEN技术制备基因敲除小鼠相关的产品或在搜索更多与TALEN技术制备基因敲除小鼠相关的内容。 查看更多
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2021-09-08
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-08-15
广州往圣生物科技有限公司在发布的OneShine CRISPR/Cas9 基因敲除细胞文库供应信息，浏览与OneShine CRISPR/Cas9 基因敲除细胞文库相关的产品或在搜索更多与OneShine CRISPR/Cas9 基因敲除细胞文库相关的内容。 查看更多
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2021-08-01
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的IDS Knockout HeLa Cell Line; IDS 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与IDS Knockout HeLa Cell Line; IDS 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与IDS Knockout HeLa Cell Line; IDS 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-09-16
动物模型是现代生命科学研究的重要工具，特别是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。近几年来，制备动物模型的基因敲除技术主要包括传统ES基因打靶、TALEN、CRISPR/Cas9， 近期又有一项新的基因敲除技术——TetraOne... 查看更多
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2021-07-14
TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。研究发现，Xanthomonas TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。研究者们利用来自Xanthomonas TAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位... 查看更多
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2017-12-10
威斯腾生物在发布的转基因/基因敲除动物模型构建服务供应信息，浏览与转基因/基因敲除动物模型构建服务相关的产品或在搜索更多与转基因/基因敲除动物模型构建服务相关的内容。 查看更多
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2018-05-22
深圳南博屹生物科技有限公司在发布的基因敲除技术供应信息，浏览与基因敲除技术相关的产品或在搜索更多与基因敲除技术相关的内容。 查看更多
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2021-09-18
动物模型是现代生命科学研究的重要工具，特别是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。近几年来，制备动物模型的基因敲除技术主要包括传统ES基因打靶、TALEN、CRISPR/Cas9， 近期又有一项新的基因敲除技术——TetraOne... 查看更多
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上海邦耀生物科技有限公司在发布的基因敲除和点突变大小鼠供应信息，浏览与基因敲除和点突变大小鼠相关的产品或在搜索更多与基因敲除和点突变大小鼠相关的内容。 查看更多
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2021-06-03
基因敲除CruiserCel同源。该酶能够高效特异地识别异源双链的突变位点，并从突变位点的端高效地切割异源双链。基因敲除 特点20min ●特异性极高：精准定位突变位点，准确得出突变数 ●检测范围广：可用于检测的片段用于、、和实验的活性检测、突变效率检测、阳性克隆筛选DNA ●SNP ● ●DNA... 查看更多
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基因编辑技术crispr/cas9和农杆菌转基因技术的不同– 960问答123
爱臌2021-08-27
中山大学人类胚胎遗传性致病基因修复实验采取了CRISPR／Cas9基因编辑技术。该技术是近年在锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术之后出现的新型基因编辑技术，原理来自细菌的适应性免疫防御机制。相比传统的基因打靶技术和其他基因编辑技术，CRISPR／Cas9更为精确、高效和经济。
科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
大肠杆菌CRISPRCas9系统基因敲除简介 123
BMW9272021-09-04
CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3
类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统
只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含
有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合
成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的
DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统
只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含
有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合
成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的
DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
crispr 和rna干扰的区别_问答详情_CRISPR基因敲除_基因编辑_分子...123
心碎娃娃RFoj92021-08-18
在一项新的研究中，来自美国北卡罗来纳州立大学的研究人员利用CRISPR-Cas系统开发出能够识别出特定的细菌菌株，切割它们的DNA，从而消除感染，而且经证实选择性除去特定的细菌菌株同时不影响有益的细菌群体是可行的。这种新方法是利用很多细菌中存在的被称作CRISPR-Cas的免疫系统来发挥作用的。这种CRISPR-Cas系统作用机制如下所示：产生小片段被称作CRISPRRNA的RNA链，与一种特定入侵者中特异性的DNA序列匹配，当这些CRISPRRNA找到这样的匹配DNA序列时，它们释放Cas蛋白来切割这种DNA序列。在这项研究中，经设计让CRISPRRNA匹配细菌自身的靶DNA序列能够让细菌自杀，这是因为细菌的CRISPR-Cas系统攻击它自身的DNA序列；在存在不同细菌组合的培养物中测试了这种方法，并且能够只清除特定的细菌菌株；这种方法清除了一种细菌物种的菌株，但是不能清除相同物种中的另一种菌株，尽管它们的基因组序列99%是相同的。
CRISPR Allinone和创建多个sgRNA配合Cas9基因敲除有什么区别?...123
wabenawn172021-08-17
是不是CRISPRall-in-one只能设置一个sgRNA？
CRISPRCas9基因敲除实验步骤 day 25？ 正式实验123
miSAKA5802021-08-06
载体里有没有抗性基因啊
【求助】是否可以直接体内注射CRISPR/Cas相关载体做基因敲除鼠...123
龙在我心2021-09-01
最新一期Nature上，张锋实验室发表了《InvivogenomeeditingusingStaphylococcusaureusCas9》，在文章中，他们用腺病毒AAV包装SaCas9和gRNA，靶向小鼠肝脏中胆固醇调节基因Pcsk9。注射AAV一周内，他们观察到>40%基因改变，血清中Pcsk9下降。那么问题来了，这种效率情况下，可否靶向精子或者卵细胞中的特定基因，然后通过交配获得杂合子，进一步获得纯合子。这样是否可行？谢谢！
http://www.nature.com/nature/journal/v520/n7546/full/nature14299.html
http://www.nature.com/nature/journal/v520/n7546/full/nature14299.html
话说CRISPR技术的利与弊123
愿萌安好5311262017-10-29
优点:使用方便，构建简单，可以覆盖大多数区域的基因编辑需求，成本低。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
大肠杆菌CRISPRCas9系统基因敲除简介123
__堶__2017-10-29
1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间 微生物 学术 科研 互...123
石原忍2021-08-04
做黄单胞，在通过Tn5构建转化子库之后，通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后，将几个可能与致病力相关的基因做了敲除，现在正在构建互补载体，已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等，不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。
通过敲除来研究基因的功能，所谓的敲除不外乎有三种情况：1）单交换插入抗性基因使原基因失活；2）抗性基因双交换替换掉原基因；3）同框缺失即完整的使原基因敲除掉。
第三种情况得到的突变株比较好但筛选工作量很大，前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子，但是由于外源的插入了抗性基因容易引起polar effect，所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的，如果是第三种情况得到的突变株不做回补也没关系，做了会更好。
通过敲除来研究基因的功能，所谓的敲除不外乎有三种情况：1）单交换插入抗性基因使原基因失活；2）抗性基因双交换替换掉原基因；3）同框缺失即完整的使原基因敲除掉。
第三种情况得到的突变株比较好但筛选工作量很大，前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子，但是由于外源的插入了抗性基因容易引起polar effect，所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的，如果是第三种情况得到的突变株不做回补也没关系，做了会更好。
求助,基因敲除工具CRISPR/Cas9和creloxp system 实验动物与...123
临界纪年2021-08-25
CRISPR/Cas9作为一种基因敲除工具来说，比现有的基因敲除工具cre-loxpsystem，它的优越性在哪儿，有没有大神可以告诉我一下，感谢！感谢！
crispr dcas9怎么同时激活和转录123
猴79825期陡2021-08-30
“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术技术近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1 CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游展开
CRISPR/cas系统敲除后,如何筛选???_问答详情_CRISPR基因敲除_...123
lwq6522021-08-02
我想问一个基础问题啊，用CRISPR/cas系统敲除某个基因后，如果突变株表型没法通过肉眼分辨，怎么把突变株找出来？要用到什么Marker吗？还是需要对细胞逐个测序检测？
如果是逐个检测，那就涉及到效率问题了，当效率比较低的时候，岂不是工作量很大？
还有cas9基因会残留在细胞里吗？
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