Highlights
- Quick, high-throughput (96-well) recovery of large-sized DNA from any enzymatic reaction or impure preparation without messy precipitations
- UniqueUnique spin column for low volume elution of ultra-pure, high-yield DNA. spin column for low volume elution of ultra-pure, high-yield DNA
- Eluted DNA is ideal for PCR, endonuclease digestion, sequencing, etc.
Description
| Applicable For | Eluted DNA is ideal for ligation, sequencing, labeling, PCR, microarray, transfection, transformation, restriction digestion procedures, and any other sensitive downstream application |
|---|---|
| Elution Volume | ≥ 15 µl of DNA Elution Buffer |
| Equipment | Centrifuge w/ microplate carriers |
| Purity | A260/A280 > 1.8, A260/A230 > 1.8 |
| Sample Source | Enzymatic reactions or impure preparations containing genomic DNA |
| Sample storage | Eluted DNA can be used immediately or stored at ≤ -20°C |
| Size Range | > 50 bp and up to 200 kb |
| Yield | Up to 5 µg DNA. Recovery of DNA ranges from 70 - 95% |
Q1: What is the lower limit and minimal amount of DNA that can be recovered?
Picogram levels of DNA can be recovered. The limitation is based on sensitivity of detection method.
Q2: How to process naked DNA stored in DNA/RNA Shield?
Use the standard protocol(add 2 or 5 volumes of DNA binding buffer depending on DNA size).
Q3: What to do if ethanol addition to the DNA Wash Buffer was omitted?
The DNA will be eluted off the column. Rebind samples using the appropriate amount of DNA Binding Buffer and wash the column with the properly prepared wash buffer.
Q4: What happens if more DNA was loaded on the columns than the stated maximum binding capacity?
Oversaturation of the column can result in total DNA loss due to clogging of silica matrix.
Q5: How many times can columns be reloaded?
We recommend no more than 5 times as binding efficiency might decrease.
Q6: What is the minimum input volume of DNA sample?
Working with volumes below 50 µl can result in decreased recovery. We recommend raising the starting volume to 100 µl with water to ensure optimal binding conditions.
| Cat # | Name | Size | Price | |
|---|---|---|---|---|
| D3004-4-4 | DNA Elution Buffer | 4 ml | $10.00 | |
| D3004-4-1 | DNA Elution Buffer | 1 ml | $11.00 | |
| D3004-4-16 | DNA Elution Buffer | 16 ml | $18.00 | |
| D3004-4-10 | DNA Elution Buffer | 10 ml | $14.00 | |
| D4003-2-24 | DNA Wash Buffer (Concentrate) | 24 ml | $33.00 | |
| D4003-2-6 | DNA Wash Buffer (Concentrate) | 6 ml | $10.00 | |
| D4003-2-48 | DNA Wash Buffer (Concentrate) | 48 ml | $60.00 | |
| D5201-1-50 | ChIP DNA Binding Buffer | 50 ml | $37.00 | |
| D5201-1-100 | ChIP DNA Binding Buffer | 100 ml | $83.00 | |
| C2010 | Zymo-Spin I-96-XL Plates | 2 Plates | $257.00 | |
| C2003 | Elution Plate | 2 Plates | $19.00 | |
| C2002 | Collection Plate | 2 Plates | $22.00 |
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
缺点:质粒仍然较大,转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性,局限了基因编辑的运用范围,而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
各位同仁大家好,最近在尝试利用CRISPR/cas9技术敲除基因,苦于手里头资源有限,只有lentiCRISPRv2以及相应的包装体系,没有pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0,无奈公司货期较久,想立刻开展实验,不知哪位同仁有此质粒并愿意交换,不甚感激。
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具,又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下,将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化,CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素:Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割,造成DNA双链断裂(DSB, double strand break)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制,主要包括两种途径:
一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ,Non-homologous end joining),此修复机制非常容易发生错误,导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel),从而造成移码突变,最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变,从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现,使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物,且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR, homology-directedrepair),这种基于同源重组的修复机制保真性高,但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下,靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑,如:条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性,高效的基因编辑能力获得青睐,成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中,媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设,推动生物科研的进步!
详细信息你可以参考:http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
1、过表达目的蛋白,用以检测基因表型;
2、荧光标签标记目的蛋白,用以跟踪其细胞 定位;
3、引入野生型等位基因。
科学家发现,细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后,可以获得其部分DNA(脱氧核糖核酸)片段并整合进基因组形成记忆,当再次遭到入侵时,转录出相应的RNA(核糖核酸),利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR/Cas9技术就是利用这一原理,用一种定制的RNA引导Cas,对预设DNA位点进行切割,造成DNA断裂,启动细胞内基因组修复机制,实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
分享到:
近年来,CRISPR/Cas9风暴席卷全球。这项基因组编辑技术在短短几年内迅速应用于世界各地的实验室,并催生了上千篇文章的发表。然而,麻省理工学院(MIT)的《Technology Review》杂志提出了一个问题,谁才是CRISPR技术的所有者?生物通 www.ebiotrade.com
一个月前,“科学突破奖”(Breakthrough Prize)揭晓。加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和德国亥姆霍兹传染研究中心的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR技术方面的重要贡献而获奖,且每人获得了300万美元的奖金。
这一领域的另一位风云人物,Broad研究院的张锋(Feng Zhang)虽然没有获得科学突破奖,但在今年4月获得了CRISPR/Cas9的首个专利。他的研究中心控制着这一技术的每个重要商业应用。生物通 www.ebiotrade.com
那么问题来了,这个备受瞩目的奖项和专利为何会落入不同人的手中?究竟是谁发明了它?“这一领域的知识产权相当复杂,”CRISPR Therapeutics公司的CEO Rodger Novak谈道。Emmanuelle Charpentier是这家公司的创始人之一。
Tech Review的记者Antonio Regalado指出,张锋与Doudna共同创立了Editas Medicine公司,它获得了Broad的技术授权。不过,在张锋成功申请专利之后,Doudna就与该公司断绝了关系。她将她的知识产权(专利申请中)授予了另一家竞争性的公司Intellia Therapeutics。然而,让事情更加复杂的是,Charpentier又将她在同一专利申请中的权利出售给了CRISPR Therapeutics。生物通 www.ebiotrade.com
此外,围绕这一技术的科学信用,那也是错综复杂。2012年夏天,Doudna、Charpentier及她们的团队发表了一篇文章,证明CRISPR/Cas9系统可以作为一种可编程的DNA编辑工具。半年后,张锋博士以及哈佛大学的George Church发表文章称它可应用于人类细胞,不久后,Doudna也发表了类似的结果。
但是,张锋表示他对Doudna和Charpentier的工作知之甚少。为了支持他的专利申请,他提交了实验室笔记本的照片,表示他在2012年年初就开始了这方面的研究,早于Doudna和Charpentier。生物通 www.ebiotrade.com
Charpentier表示:“我可以说的是,我和Jennifer Doudna是在我的实验室中开展研究。这里的一切都很夸张,因为这是一项人们很容易学会的技术。事情发生得太快了。”
Regalado在文中写道:“目前还没有CRISPR药物。但是如果CRISPR真的如科学家想象得那么重要,对这一基本技术的商业控制将价值数十亿美元。”也许,这场专利之战才刚刚开始。(生物通 薄荷)
我想问一个基础问题啊,用CRISPR/cas系统敲除某个基因后,如果突变株表型没法通过肉眼分辨,怎么把突变株找出来?要用到什么Marker吗?还是需要对细胞逐个测序检测?
如果是逐个检测,那就涉及到效率问题了,当效率比较低的时候,岂不是工作量很大?
还有cas9基因会残留在细胞里吗?

