| Product Name | HIV Protease FRET Substrate IDABCYL - GABA - Ser - Gln - Asn - Tyr - Pro - Ile - Val - Gln - EDANS |
| Size | 1 mg |
| Catalog # | AS-22992 |
| US$ | $238 |
| Purity | % Peak Area By HPLC ≥ 95% |
DABCYL-GABA-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-EDANS is also called HIV protease substrate I in some literature. It is widely used for the continuous assay for HIV protease activity. The 11-kD protease (PR) encoded by the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) is essential for the correct processing of viral polyproteins and the maturation of infectious virus, and is therefore a target for the design of selective acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) therapeutics. The FRET-based fluorogenic substrate is derived from a natural processing site for HIV-1 PR. Incubation of recombinant HIV-1 PR with the fluorogenic substrate resulted in specific cleavage at the Tyr-Pro bond and a time-dependent increase in fluorescence intensity that is linearly related to the extent of substrate hydrolysis. The fluorescence quantum yields of the HIV-1 PR substrate in the FRET assay increased by 40.0- and 34.4-fold, respectively, per mole of substrate cleaved. Because of its simplicity and precision in the determination of reaction rates required for kinetic analysis, this substrate offers many advantages over the commonly used HPLC or electrophoresis-based assays for peptide substrate hydrolysis by retroviral PRs. Abs/Em = 340nm/490nm. Minimum Purity: 95% | |
| Detailed Information |  Datasheet Material Safety Data Sheets (MSDS) |
| Storage | -20°C |
| References | Anjuere, F. et al.(1993). Sensitive, hydrosoluble, macromolecular fluorogenic substrates for human immunodeficiency virus 1 proteinase. Biochem J 291 (Pt 3), 869-73, Geohegan KF, et al. (1990). Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiency virus-1. FEBS Lett 262, 119-22. |
| Molecular Weight | 1532.5 |
| DABCYL-GABA-SQNYPIVQ-EDANS | |
| Sequence(Three-Letter Code) | DABCYL - GABA - Ser - Gln - Asn - Tyr - Pro - Ile - Val - Gln - EDANS |
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科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。向左转|向右转
通过敲除来研究基因的功能，所谓的敲除不外乎有三种情况：1）单交换插入抗性基因使原基因失活；2）抗性基因双交换替换掉原基因；3）同框缺失即完整的使原基因敲除掉。
第三种情况得到的突变株比较好但筛选工作量很大，前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子，但是由于外源的插入了抗性基因容易引起polar effect，所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的，如果是第三种情况得到的突变株不做回补也没关系，做了会更好。
科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
http://www.nature.com/nature/journal/v520/n7546/full/nature14299.html
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
从2011年科学家实现TALEN技术，2013年科学家实现CRISPR/Cas9技术，这些技术的迅速成熟都给基础生物学研究、临床医学研究提供了更为方便和快捷的分子生物学工具。技术进步必将在未来给科学研究及基因治疗研究带来更为广泛的发力！这在2014年以来的频频出现的Cas9技术在各个领域的应用进展中可以清晰看到。欢迎感兴趣的朋友联系我交流这些方面的进展。
关于这些技术的具体原理和操作细节，请查看我之前的帖子附件详细介绍，TALEN，CRISPER/Cas9技术做基因敲除技术资料-蚂蚁淘论坛。不清楚的请联系我咨询。此贴主要谈一谈在用这些技术进行癌细胞株阳性细胞克隆筛选的过程中，如何进行阳性克隆筛选，为初次接触这些新技术的研究者提供一些参考意见。
一般CRISPER-Cas9质粒转染后，采用有限稀释法接种到96孔板中长克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，显微镜下仔细观察每一个孔的细胞，若发现非单克隆的细胞需要将其标注出来剔除筛选之外。传两代后，取出单个克隆的一部分细胞提取基因组DNA。
分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择部分阳性克隆进行PCR产物或做T载克隆送测序进行最终确认。
目前推崇的各种识别错配碱基的酶切鉴定方法及Surveyorassay试剂盒由于假阳性过高及过于昂贵，一般实验室我们不建议使用。少数试剂酶公司对于酶的推荐有利益因素驱动，希望各位战友注意甄别，土豪请忽略。(*^__^*)
运用CRISPER-Cas9技术进行癌细胞系的基因敲除，我们的经验是若设计的CRISPER-Cas9载体表达水平够高，敲除效率够高，此步骤多数时候可以直接省略。
详细的Protocol这里给出sigma最早ZFN的protocol，请查阅附件。这份protocol很经典，各位战友可以参考认真阅读一下。其他注意点如下，供参考。欢迎战友们补充。
建议一三事：(土豪别忽略)
1.土豪购买Surveyorassay的kit链接:
http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/surveyor-mutation-detection-kits
2.转染的时候就按照转染试剂推荐的DNA用量转染就可以。目前有Cas9和gRNA分别在两个不同的载体上的，也有在同一个载体上的，两个载体上的那套体系，建议转染时质粒DNA用量摩尔比例1：1。
3.设计上下游引物时，PCR产物的大小最好是四五百bp长比较合适，gRNA的targeting位点并不需要正好在PCR产物的中间。
4.做surveyorassay时用的PCRmix我们就是用的Sigma的JumpStartReadyMix，这个是热启动的Taq酶，mix里面没有DNA染料，可以直接用于surveyorassay。
5.分完96孔板之后大概一个星期能长出大小比较合适的单克隆，因为分细胞的时候不能保证完全均匀，有的孔里可能会长出2个或更多细胞克隆，所以需要在显微镜下把有多个克隆的孔剔除掉。我们习惯将96孔板里的单克隆消化下来再转到一个新的96孔板里，长满之后1/4-1/5再传代，剩下的细胞裂解之后提基因组DNA做surveyorassay。挑克隆鉴定的工作量比较大。
6.5中的两次传代目的是为了去除掉细胞培养基及细胞内的参与相关CRISPER-Cas9载体，以免形成二次切割，所获得的克隆不纯。建议最好要做这样一部操作。
7.更多详细的实验细节操作，欢迎联系我咨询或仔细阅读附件中的文件。
此贴若对您实验有帮助，记得常回来踩踩，道声感谢，给个力赞、怒赞啥的，鄙人不图其他，图个能帮助到更多的蚂蚁淘的战友们。也欢迎跟帖提问。我不定期回答大家的疑问。欢迎分享、转发、收藏给您的好友、同事、同学及***等。好东西请别自己独自藏着掖着。
预祝您实验顺利！
这个部分的PS也很重要，希望能够引起，特别是土豪们的注意。那就是关于癌细胞株用来从事科学研究之我见，供参考。欢迎战友们补充。土豪我们做朋友吧。嘻嘻！
PS一三事：（土豪请重视）
1.在癌细胞系上做基因敲除，科学家有此想法由来已久。HGP后，科学家能够读取基因信息，RNAi现象的发现被很快开发并运用到基因的敲低工作中来，虽然不能达到彻底敲除的目的，但至少在那个时代，在各方面数据及对照做足的情况下，给科学进步确实带来了很大帮助。
2.做过癌细胞株染色体相关的工作的科学家一定看过或者一定知道癌基因组的Variety是非常大的，很多时候对门实验室养的Hela细胞或者293T细胞和自己养的情况都不一定一样。染色体的各种缺失、多拷贝、异位、反转等等情况时有发现及发生，也不断在癌化当中。
3.针对2中的考虑，如果我们所研究的基因恰恰与癌细胞株的种种变异相关上，在此癌细胞株上做基因敲除就会有各种风险，土豪们需要额外注意选择一个合适的细胞系可能很关键。
4.所感兴趣基因的功能对于癌细胞本身的生长等是否会造成影响，这点的风险其实对于做基因敲除来讲也是存在的，虽然一般不会有大的影响。
5.根据我们的经验，至少CRISPER-Cas9技术基因敲除细胞系获得杂合子敲除（包含三整倍数aa的缺失或插入）阳性细胞克隆的获得概率约为10%；纯合子获得概率约为30%。不同基因情况不同，数据仅供参考，有时或高或低。
6.如果一次很难获得基因敲除纯合子的癌细胞克隆，癌细胞无法实现小鼠繁育类似的杂合子间交配获得纯合子，只能再次转染筛选。
7.不管是癌细胞培养还是RNAi技术（主要指shRNA），都是在一定的特殊历史时期或者科学家经费有限情况下的特殊时期的“无奈”选择。那个年代获得基因修饰动物及饲养动物成本要肯定远远比培养细胞高多了。
8.RNAi技术所在的一个特殊历史阶段，科学家无法很快及较低成本做到细胞系或小鼠个体水皮上的彻底敲除，只能退而求其次，实现在细胞或小鼠上敲低，再辅以其他数据与严格对着呼应。
9.如果土豪您有能力，请告诉我们您的心声，截止2014年获得CRISPER-Cas9基因敲除、基因敲入、基因条件性敲除、多基因、基因大片段（如两个，三个、甚至更多）敲除的小鼠获得的周期及成本越来越低。
10.动物水平实验研究的意义要远远超过细胞株实验的意义，这点自不必说。但细胞株实验的较高通量来筛选候选基因也有其固有的优势。
11.从整个细胞株建系周期及成本上看，和基因敲除动物相比，彼此彼此，没有绝对的优势。
CRISPER-Cas9技术筛选基因敲除细胞系阳性克隆Protocol-上海南方模式生物研究中心.pdf(310.12k)
CompoZrCustomZincFingerNuclease(ZFN)TechnicalBulletin-GenomeEditingProtocol.pdf(817.12k)
2月16日，美国专利及商标局传来重磅消息——该部门宣布，隶属于哈佛大学与麻省理工学院的Broad研究所继续保有2014年获批的CRISPR-Cas9应用专利，也让这项**性基因编辑工具的专利之争大体尘埃落定。
▲三行文字，决定了这项专利的归属（图片来源：STAT）
毫无疑问，CRISPR-Cas9基因编辑系统是本世纪最为重要的生物发现之一。2015年，《科学》将它评为年度突破；助力这项技术诞生的科学家们也先后获得了有“科学界奥斯卡”之称的“突破奖”（BreakthroughPrize），在分子生物学界影响深远的“格鲁伯遗传学奖”（GruberGeneticsPrize），以及表彰重大生物医学突破的“沃伦·阿尔珀特奖”（WarrenAlpertPrize）。
CRISPR-Cas9基因编辑系统能取得今天的成功，绝非一名科学家的功劳。2012年，JenniferDoudna教授与EmmanuelleCharpentier教授在《科学》杂志上发表文章，确认CRISPR-Cas9系统在体外实验中能“定点”对DNA进行切割。两个月后，VirginijusSiksnys教授在《PNAS》杂志上发表了类似的研究。这些论文表明CRISPR-Cas9系统作为基因编辑工具的巨大潜力。
2013年，张锋教授的研究团队在《科学》杂志上发表了一篇重磅研究：他们首次在哺乳动物内应用了CRISPR-Cas9系统，并确认它能在几周内建立起小鼠的疾病模型。此外，张锋教授的团队也首次在人体细胞内成功地用CRISPR-Cas9系统完成了基因编辑。
▲张锋教授团队率先在哺乳动物细胞中应用了CRISPR-Cas9技术（图片来源：STAT）
科学突破需要群策群力，专利申请却并非如此。2012年，加州大学伯克利分校与Broad研究所/麻省理工学院先后向美国专利及商标局递交了CRISPR应用的专利申请。2014年4月，美国专利及商标局为后者率先颁发了专利，而前者的申请至今未得到批准。加州大学伯克利分校认为，Doudna教授与Charpentier教授等人的研究在CRISPR的应用中起到了奠基性的作用，因此Broad研究所获得的专利值得商榷。2016年1月，美国专利及商标局展开了进一步的调查，并于今日做出判决——三名法官认为“nointerferenceinfact”。
业内媒体STAT在一则报道中指出，这短短的四个单词，意味着Broad研究所在2014年获得的关键性CRISPR专利，与加州大学递交的专利申请有足够多的不同。
▲CRISPR相关专利申请一览
“我们递交的专利并非首个与CRISPR应用相关的专利，但它们是首批描述这一发明用于哺乳动物基因组编辑的专利。”Broad研究所在今天发布的一份声明中提到。
值得一提的是，今日的专利判决并不会影响CRISPR-Cas9系统在科学界的应用。作为一家非营利性科研机构，Broad研究所乐于将突破性的发现分享给全球科学界，造福人类健康。因此，Broad研究所也将继续与Addgene（非营利性质粒库）合作，分享这一重要研究工具。自2013年以来，全球59个国家的2000多家研究所已经从Addgene处获得了37000多个与CRISPR-Cas9相关的质粒与试剂。此外，Broad研究所也在今日发表的声明中宣布，将继续为业界的合作伙伴们提供相关研发工具。
张锋博士是麻省理工学院历史上最年轻的华人终身教授。去年，张锋教授作为“下一代领袖”（NextGenerationLeaders）之一，登上了《时代周刊》亚洲版的封面。在报道中，《时代周刊》认为他的工作给CRISPR-Cas9系统带来了巨大变革，让科学家们能够完成先前不敢设想的工作。如今，我们有望能清除每一个受感染细胞中的艾滋病病毒，或是治疗镰刀状红细胞贫血症等经典的遗传疾病。甚至，科学家们已经畅想利用它来攻克癌症的可能。此外，它也能在植物的基因组中得到应用。这能带来全新的生物能源，或带来性状更稳定的作物。
我们期待看到CRISPR-Cas9带来更多有望造福人类的应用！
参考资料：
[1]FORJOURNALISTS:STATEMENTANDBACKGROUNDONTHECRISPRPATENTINTERFERENCEPROCESS
[2]BroadInstituteprevailsinheateddisputeoverCRISPRpatents
[3]张锋教授登上《时代周刊》封面：编辑基因组的下一代领袖
