2xBlueStarTMPCRMasterMixcontainsallthenecessaryreagentsandagelloADIngdye.ThePCRmixcanbedirectlyloadedontoaDNAgel.
Description: The2XBlueStar™PCRMasterMixisapre-mixed2XconcentratedsolutioncontainingHoTaq™DNAPolymerase,reactionbuffer,gelloadingdye,MgCl2anddNTPs.TheHoTaq™DNAPolymeraseoffershotstartPCRforroomtemperaturereactionset-up.The2XBlueStar™PCRMasterMixisidealforapplicationsrequiringhighyieldsandroutinePCRlaboratoryuse,suchasSNPanalysisandhighthroughputend-pointPCR. Comparison: Features: 
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                                                    做黄单胞,在通过Tn5构建转化子库之后,通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后,将几个可能与致病力相关的基因做了敲除,现在正在构建互补载体,已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等,不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。
目前,来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA(single guide RNA)。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力,但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下:
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有(汉恒生物提供cas9质粒试剂盒):
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果,但是质粒转染具有效率低,作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题,常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒,慢病毒常用质粒见addgene(lentiCRISPR v2,lentiGuide-Puro,lentiCas9-Blast),慢病毒可以整合入宿主基因组中,长期稳定的表达(汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装),但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大(大于4kb),且长期插入可能导致乱切,脱靶等,同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因,腺病毒更有优势,腺病毒克隆能力强,获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说,作用是时间也比较长,可以达到更理想的敲除效果。
缺点:质粒仍然较大,转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性,局限了基因编辑的运用范围,而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统
只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前,来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含
有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合
成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的
DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统。
http://www.addgene.org/crispr/guide/
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具,又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下,将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化,CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素:Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割,造成DNA双链断裂(DSB, double strand break)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制,主要包括两种途径:
一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ,Non-homologous end joining),此修复机制非常容易发生错误,导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel),从而造成移码突变,最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变,从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现,使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物,且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR, homology-directedrepair),这种基于同源重组的修复机制保真性高,但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下,靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑,如:条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性,高效的基因编辑能力获得青睐,成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中,媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设,推动生物科研的进步!
详细信息你可以参考:http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html

                                    
                    
