荧光定量PCR，模板浓度够高，CT仍30多，原因何在
2021-08-15
问题描述：
realtimeRT-PCR，测了模板CDNA浓度1800ng/ml，纯度在1.96左右，但是检测内参GAPDH，CT值都有30多，目的基因的CT更大了。请问问题在哪里，CT值大不就是因为模板量不够吗，可是现在这个浓度显然是充足的，怎么解释？
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什么没看
用户
tm值是否为单峰，调整为低浓度，或者倍比稀释看看，浓度大有时候并不是好事
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chixinzero
用户你的CDNA浓度是怎么测出来的？一般测的不是RNA浓度嘛？cDNA因为反转的加入了很多dNTP所以不准的
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Mis願
用户什么没看tm值是否为单峰，调整为低浓度，或者倍比稀释看看，浓度大有时候并不是好事是单峰的，稀释了10后，内参的CT值又大了
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Mis願
用户chixinzero你的CDNA浓度是怎么测出来的？一般测的不是RNA浓度嘛？cDNA因为反转的加入了很多dNTP所以不准的我是反转录后测的cDNA浓度。是从六孔板一空的细胞用trizol提的RNA，是细胞太少了吗？有一次也测过RNA，浓度有700ng/ml左右，但没做PCR。
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chixinzero
用户Mis願我是反转录后测的CDNA浓度。是从六孔板一空的细胞用trizol提的RNA，是细胞太少了吗？有一次也测过RNA，浓度有700ng/ml左右，但没做PCR。你在反转的时候，其实加入的很多的dNTP，但是测浓度的原理，也是测碱基的含量，所以你测cDNA的浓度肯定不对的，还有就是一般我们反转都会测完RNA浓度后统一配平到一个浓度，以此来确定cDNA浓度
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Mis願
用户chixinzero你在反转的时候，其实加入的很多的dNTP，但是测浓度的原理，也是测碱基的含量，所以你测CDNA的浓度肯定不对的，还有就是一般我们反转都会测完RNA浓度后统一配平到一个浓度，以此来确定cDNA浓度配平具体怎么做，怎么来确定cDNA的浓度。对咯，我是做相对定量的，这个有关系吗？
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chixinzero
用户其实没关系的，每个反转试剂都有具体的说明的吧，我用过两个都说让配成统一浓度的
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a-do34
用户Mis願realtimeRT-PCR，测了模板CDNA浓度1800ng/ml，纯度在1.96左右，但是检测内参GAPDH，CT值都有30多，目的基因的CT更大了。请问问题在哪里，CT值大不就是因为模板量不够吗，可是现在这个浓度显然是充足的，怎么解释？给你个建议，换个试剂盒试一下。如果RNA跑胶没问题的话。
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bilina
用户Mis願realtimeRT-PCR，测了模板CDNA浓度1800ng/ml，纯度在1.96左右，但是检测内参GAPDH，CT值都有30多，目的基因的CT更大了。请问问题在哪里，CT值大不就是因为模板量不够吗，可是现在这个浓度显然是充足的，怎么解释？学习
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吖美
用户溶解曲线单峰，那么温度值是多少？如果低于80很有可能都是引物二聚体，有没有阴性对照？看阴性对照的值和样品值是否相近。内参都那么大的值，很怀疑模板有问题，或者引物有问题啊，你可以先跑个普通pcr试试，看看能否跑出单一目的条带
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7king
用户是不是RT试剂或PCR试剂出问题了？先换个PCR试剂跑跑看。我100ng的总RNA的RT产物GAPDH的CT值也16左右，应该不是样本太少的问题。
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Mis願
用户最后问题所在是，要把提好的RNA稀释到反转录说明书（TAKARA）要求的10ul体系中最大加入量500ng以下，这样内参GAPDH的Ct基本都在14-17之间
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