【求助】real time PCR 能否用普通taq酶系统来做？
2021-08-01
问题描述：
最近要做realtimePCR，taqman探针法，没有买市场上的产品，可否先用普通taq酶试试？
这样设想的前提是因为，普通Taq酶也具有5‘－3’外切酶活性，如果可以的话，与普通PCR相比，反应体系需要做什么样的改动呢？
用的是ABI的机器。
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dujiaoshou
用户
帮你顶一下,我也想知道.不过我是做sybr green i的.:)
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sf20960
用户可以呀,我们实验室的ABI-7700一直是用普通taq酶做呀.包括探针法和染料法在内.
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tinkocoldmoon
用户那请问sf20960，你们的体系也是用普通反应体系么？大多数普通taq酶附带的buffer是有Mg离子的，我看文献上说，realtime的Mg离子终浓度要比普通PCR高一些的，你们调整了么？能不能把您的反应体系以及反应条件分享一下呢？谢谢啦^_^
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sf20960
用户我们用的是20*buffer,里面没有Mg离子,自己调整Mg离子用量.realtime的Mg离子终浓度要比普通PCR高一些.50微升体系用浓度为50uM镁离子2.0微升,一般的用1.5ul左右.条件:94度300s94度15s60度60s40循环
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sf20960
用户我们试验室大量用酶,而普通taq酶比较便宜,经费又有限,所以.......如果你们条件好的话,最好换贵的,那样效果更好!
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calab
用户没问题.Mg2+也不是那么精确,有必要么.
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tinkocoldmoon
用户谢谢sf20960，calab
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dujiaoshou
用户那有用单独的sybrgreeni做的好的XDJM吗?
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tinkocoldmoon
用户呵呵，我原来就用sybr做。。。。
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dujiaoshou
用户我说的意思是有没用单买的SYBRGREENI做real-timePCR的,因为很多都是用公司的MIX的,而我由于经费有限想把SYBRGREENI买过来,和普通PCR一样加样做,请有用这个做的效果好的吗?谢谢.
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tinkocoldmoon
用户我们就是单买的sybr，买的是10000×的，稀释成20×的，然后加入普通PCR体系中，效果相当的好，呵呵但是SYBR本身也不是特便宜啊……
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liuyuefengzhang
用户最好不要这样做。普通Taq酶只要温度合适，其活性就会使反应开始进行，如果你加样时间长，或者房间里的温度比较高，结果就会产生非特异性产物，影响你的定量。Real-timePCR最好使用HotstartDNApolymerase，这种酶的酶活只有在94度或95度加热几分钟才能够被激活，所以不会有普通Taq酶那样的问题。如果不用mix，就需要用HotstartDNApolymerase，当然，反应体系与常规PCR稍有不同，亦是要优化的，否则也会影响你的扩增效率。
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