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荧光定量pcr的ct值偏高如何解决
2017-08-19
问题描述:

组织用Trizol法提取总RNA浓度、纯度都很好,但逆转录后跑PCR,CT值偏高,内参的在22-27之间,目的基因在30-36之间,不知道是怎么回事,如何来解决,求高手赐教。我用的Takara的试剂盒

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wusofa
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kenna 组织用Trizol法提取总RNA浓度、纯度都很好,但逆转录后跑PCR,CT值偏高,内参的在22-27之间,目的基因在30-36之间,不知道是怎么回事,如何来解决,求高手赐教。我用的Takara的试剂盒。一般组织或临床样本的CT值会比细胞的高一点,但你这个有点太高!有几个可能性。1、最有可能是RNA降解严重,按你的ct值来看,可能10%的RNA都降解了。建议电泳看看RNA是不是降解比较严重。2、逆转可能出问题,可能是逆转试剂有问题,也可能逆转程序没设置好,也可能是逆转前RNA没有预热变性。建议重新收个细胞抽RNA按标准程序逆转一下,看看ct值会不会正常。3、有DNA污染,不知道你是怎么抽提的,组织研磨之后有没有用PBS洗,可能在抽提的时候有DNA混进去了,如果担心有DNA酶污染就用DNASE I处理一下再逆转。祝实验顺利,欢迎随时交流探讨
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kenna
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展开引用wusofa一般组织或临床样本的CT值会比细胞的高一点,但你这个有点太高!有几个可能性。1、最有可能是RNA降解严重,按你的ct值来看,可能10%的RNA都降解了。建议电泳看看RNA是不是降解比较严重。2、逆转可能出问题,可能是逆转试剂有问题,也可能逆转程序没设置好,也可能是逆转前RNA没有预热变性。建议重新收个细胞抽RNA按标准程序逆转一下,看看ct值会不会正常。3、有DNA污染,不知道你是怎么抽提的,组织研磨之后有没有用PBS洗,可能在抽提的时候有DNA混进去了,如果担心有DNA酶污染就用DNASEI处理一下再逆转。祝实验顺利,欢迎随时交流探讨......我是提完RNA接着逆转的,难道这么快就降解了。我用的takara的RNAisoPlus,是不是不太适合提组织的?别人提的细胞rna做的都很好。我自己也觉得逆转录做的不是很好,因为是用金属浴完成的,感觉不是很标准(但是别人也是用这种方法也没出现我的问题),我用的takara的逆转录试剂盒有一步去DNA酶反应。非常感谢您的指导,我再逐步排除一下吧。
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wusofa
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展开引用kenna我是提完RNA接着逆转的,难道这么快就降解了。我用的takara的RNAisoPlus,是不是不太适合提组织的?别人提的细胞rna做的都很好。我自己也觉得逆转录做的不是很好,因为是用金属浴完成的,感觉不是很标准(但是别人也是用这种方法也没出现我的问题),我用的takara的逆转录试剂盒有一步去DNA酶反应。非常感谢您的指导,我再逐步排除一下吧。......没用过这个试剂盒。一般组织抽提有两个因素影响比较大,一个是组织没破碎好,导致裂解不完全。一个是临床取的组织细胞由于前期没保存好,里面RNA可能降解。至于逆转,我也用金属浴做过,没什么问题。可能还是其他小细节没注意
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halfway
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调整一下引物浓度和模板浓度试试
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