- GreatTaqPolymeraseperformanceatalowprice.
- Choiceofreactionbuffers,withorwithoutMgCl2.
- Non-proofreADIngPolymerase
FreeSampleAvailable
At$96for1000unitslistprice(quantitydiscountsavailable),EconoTaq’slowpriceiscoupledwithhighqualityandperformance.
QCspecificationsforEconoTaqarerigorous:
- Greaterthan99%purebySDSgelelectrophoresis(seeFigure1).
- NodetectableDNAcontaminationasdeterminedbyPCRusinggenericprimers.
- Nodetectableendonuclease(nicking)activity.Incubationof10UofEconoTaqDNAPolymerasewith1µgofsupercoiledpBR322DNAfor16hoursat70°Cresultsinnodetectableconversiontorelaxedorlinearformsbyagarosegelelectrophoresis.
- Nodetectableexonucleaseactivity.Incubationof10UofEconoTaqDNAPolymerasewith1µgofHindIII-cutlamBDaDNAfor16hoursat70°Cresultsinnosmearingofbandsonagarosegels.
EconoTaqPerformance
AsshowninFigures2and3Lucigen’sEconoTaqDNAPolymeraseperformsaswellas,orbetterthan,moreexpensiveTaqpreparationsfromseveralothersuppliersinroutinePCR.EconoTaqisaseffectiveinDNAamplificationasanotherstandardPCRenzyme,TflDNApolymerase(Figure4).Inthiscase,thebackgroundofnon-specificamplificationwasmuchlowerwithEconoTaq(compare“+”and“–“lanesforEconoTaqandTflinFigure4).EconoTaqDNAPolymerasealsooffershighlot-to-lotreproducibilityandreliABIlity(Figures2and4)
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Figure1.HighpurityofEconoTaqDNAPolymerase(SDSPAGE).Lane1,broadrangemolecularweightMarkers;Lane2,LucigenEconoTaqDNAPolymerase | Figure2.TaqDNApolymerasefromPromegaandNewEnglandBiolabswerecomparedtoLucigen’sEconoTaqDNAPolymerase(2differentlots)inamplifyingtheampicillingene(0.8kb)inapUC19vector.(–),noDNA.(+),DNAadded(40ng).MW,1kbladder. |
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Figure3.EconoTaqvs.AmpliTaq®(AppliedBiosystems)DNApolymeraseingenotyping.AllPCRreactionswereperformedinaRoboCycler96(Stratagene).Hip1genotypingwasperformedusingthefollowingPCRconditions:94°Cfor1min,35cyclesof94°Cfor30sec,62°Cfor60sec,72°Cfor90sec,and72°Cfor7min.Shh,CdoandGas1genotypingwereperformedusingthefollowingPCRconditions:94°Cfor2min,35cyclesof94°Cfor60sec,65°Cfor60sec,72°Cfor90sec,and72°Cfor7min.AllPCRreactionscontainedfinalconcentrationsof1µMofeachprimer,200µMdNTPs,1Xcresolredloadingdye,and1UoftheindicatedTaqpolymerase.SequencesforallPCRprimershavebeenpreviouslypublished(referencesavailable). |
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Figure4.PCRamplificationwasperformedunderstandardconditionsusingthreedifferentlotsofEconoTaqDNAPolymeraseandbuffer,orduplicatereactionswithTflDNApolymeraseandbuffer(Promega).Reactionscontainedprimersspecificforthe16SribosomalRNAgene,withBacillusgenomicDNA(+)ornoDNA(-)asatemplate(1450bpproductexpected). |
PleaseNote:
SomeapplicationsinwhichLucigen'sEconoTaqDNAPolymerasecanbeusedmaybecoveredbypatentsissuedandapplicableintheUnitedStatesandcertainothercountries.Becausepurchaseofthisproductdoesnotincludealicensetoperformanypatentedapplication,usersofthisproductmayberequiredtoobtainapatentlicensedependingupontheparticularapplicationinwhichtheproductisused.ThePCRprocessisthesubjectofEuropeanPatentNos.201,184and200,262ownedbyHoffman-LaRoche.ThosepatentsexpiredonMarch28,2006.ThecorrespondingPCRprocesspatentsintheUnitedStatesexpiredonMarch29,2005.Itisthesoleresponsibilityofthebuyertoensurethatuseoftheproductdoesnotinfringethepatentrightsofthirdparties.
ORDERINFORMATION
EconoTaqDNAPolymeraseisprovidedwithachoiceof10XReactionBufferwithMg++(“withMg++”);or10XReactionBufferwithoutMg++andaseparatetubeof25mMMgCl2(“separateMg++”).PleaseinquireforBulkpricing!ebiomall.com
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在另外的一组管子中，加入已知拷贝数的DNA同时扩增，每个管子中加入的数量是不同的，但是从最小数目到最大数目的这个范围涵盖了样本中DNA拷贝数。
PCR反应完成后，把已知拷贝数DNA的量和PCR荧光Ct值制成标准曲线，再把待测样本的CT值和该标准曲线比对，就可以得到样本中的起始拷贝数了
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’；5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’；5’的比值在1，反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
荧光定量PCR较普通PCR不同的一点就是可以实时检测PCR扩增产物，从而可进行绝对定量或者相对定量。
国产的有上海宏石，枫岭，中山达安基因，上海科华生物，大约10-15万。
进口的有ABI公司的大约45万，罗氏诊断的大约40万，Bio-Rad的大约30万。
一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下：
对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
几点注意：
1。必须确定扩增的特异性
2。 只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。 2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。 最好不用Syber Green
标准品的荧光强度和已知的浓度作图，可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后，就可以在标准曲线上算出样本浓度了。
