- GreatTaqPolymeraseperformanceatalowprice.
- Choiceofreactionbuffers,withorwithoutMgCl2.
- Non-proofreADIngPolymerase
FreeSampleAvailable
At$96for1000unitslistprice(quantitydiscountsavailable),EconoTaq’slowpriceiscoupledwithhighqualityandperformance.
QCspecificationsforEconoTaqarerigorous:
- Greaterthan99%purebySDSgelelectrophoresis(seeFigure1).
- NodetectableDNAcontaminationasdeterminedbyPCRusinggenericprimers.
- Nodetectableendonuclease(nicking)activity.Incubationof10UofEconoTaqDNAPolymerasewith1µgofsupercoiledpBR322DNAfor16hoursat70°Cresultsinnodetectableconversiontorelaxedorlinearformsbyagarosegelelectrophoresis.
- Nodetectableexonucleaseactivity.Incubationof10UofEconoTaqDNAPolymerasewith1µgofHindIII-cutlamBDaDNAfor16hoursat70°Cresultsinnosmearingofbandsonagarosegels.
EconoTaqPerformance
AsshowninFigures2and3Lucigen’sEconoTaqDNAPolymeraseperformsaswellas,orbetterthan,moreexpensiveTaqpreparationsfromseveralothersuppliersinroutinePCR.EconoTaqisaseffectiveinDNAamplificationasanotherstandardPCRenzyme,TflDNApolymerase(Figure4).Inthiscase,thebackgroundofnon-specificamplificationwasmuchlowerwithEconoTaq(compare“+”and“–“lanesforEconoTaqandTflinFigure4).EconoTaqDNAPolymerasealsooffershighlot-to-lotreproducibilityandreliABIlity(Figures2and4)
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Figure1.HighpurityofEconoTaqDNAPolymerase(SDSPAGE).Lane1,broadrangemolecularweightMarkers;Lane2,LucigenEconoTaqDNAPolymerase | Figure2.TaqDNApolymerasefromPromegaandNewEnglandBiolabswerecomparedtoLucigen’sEconoTaqDNAPolymerase(2differentlots)inamplifyingtheampicillingene(0.8kb)inapUC19vector.(–),noDNA.(+),DNAadded(40ng).MW,1kbladder. |
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Figure3.EconoTaqvs.AmpliTaq®(AppliedBiosystems)DNApolymeraseingenotyping.AllPCRreactionswereperformedinaRoboCycler96(Stratagene).Hip1genotypingwasperformedusingthefollowingPCRconditions:94°Cfor1min,35cyclesof94°Cfor30sec,62°Cfor60sec,72°Cfor90sec,and72°Cfor7min.Shh,CdoandGas1genotypingwereperformedusingthefollowingPCRconditions:94°Cfor2min,35cyclesof94°Cfor60sec,65°Cfor60sec,72°Cfor90sec,and72°Cfor7min.AllPCRreactionscontainedfinalconcentrationsof1µMofeachprimer,200µMdNTPs,1Xcresolredloadingdye,and1UoftheindicatedTaqpolymerase.SequencesforallPCRprimershavebeenpreviouslypublished(referencesavailable). |
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Figure4.PCRamplificationwasperformedunderstandardconditionsusingthreedifferentlotsofEconoTaqDNAPolymeraseandbuffer,orduplicatereactionswithTflDNApolymeraseandbuffer(Promega).Reactionscontainedprimersspecificforthe16SribosomalRNAgene,withBacillusgenomicDNA(+)ornoDNA(-)asatemplate(1450bpproductexpected). |
PleaseNote:
SomeapplicationsinwhichLucigen'sEconoTaqDNAPolymerasecanbeusedmaybecoveredbypatentsissuedandapplicableintheUnitedStatesandcertainothercountries.Becausepurchaseofthisproductdoesnotincludealicensetoperformanypatentedapplication,usersofthisproductmayberequiredtoobtainapatentlicensedependingupontheparticularapplicationinwhichtheproductisused.ThePCRprocessisthesubjectofEuropeanPatentNos.201,184and200,262ownedbyHoffman-LaRoche.ThosepatentsexpiredonMarch28,2006.ThecorrespondingPCRprocesspatentsintheUnitedStatesexpiredonMarch29,2005.Itisthesoleresponsibilityofthebuyertoensurethatuseoftheproductdoesnotinfringethepatentrightsofthirdparties.
ORDERINFORMATION
EconoTaqDNAPolymeraseisprovidedwithachoiceof10XReactionBufferwithMg++(“withMg++”);or10XReactionBufferwithoutMg++andaseparatetubeof25mMMgCl2(“separateMg++”).PleaseinquireforBulkpricing!ebiomall.com
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两步法，是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度，而且定量PCR的产物都很短，需要的时候都短，所以两步法更方便。三步法的话，花的时间长，不利于快速实验。
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’；5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’；5’的比值在1，反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
Real time PCR(也称实时定量PCR)
定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。
实时荧光定量PCR 技术的主要应用：
1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等
2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证
3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等
Realtime PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）
SYBR green
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
此方法适用：
1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上
2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。
3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。
4、高通量大规模的定量PCR检测
5、专一性要求不高的定量PCR检测。
Taqman Probe
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
此方法适用：
1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。
2、适用于扩增序列专一的体系的检测。
3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。
4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。
5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。
6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。
国产的有上海宏石，枫岭，中山达安基因，上海科华生物，大约10-15万。
进口的有ABI公司的大约45万，罗氏诊断的大约40万，Bio-Rad的大约30万。
这样设想的前提是因为，普通Taq酶也具有5‘－3’外切酶活性，如果可以的话，与普通PCR相比，反应体系需要做什么样的改动呢？
用的是ABI的机器。
荧光定量PCR较普通PCR不同的一点就是可以实时检测PCR扩增产物，从而可进行绝对定量或者相对定量。
