
Ahighquality,TaqDNApolymeraseforroutinePCRapplications
Pure:ContaminatingbacterialDNAisvirtuallyeliminatedfromthishighlypureenzymepreparation
- FlexIBLe:Suitableforsingle-targetandmultiplexPCRapplications
MasterAmp™TaqDNAPolymeraseisaThermostableDNApolymerasederivedfromThermusaquaticus.Havingoptimalactivityattemperaturesabove70°C,itwasthefirstthermostableenzymeusedforPCR.Ithasanintrinsic5´to;3´structure-dependentexonucleaseactivity,butlacks3´to;5´proofreADIngexonucleaseactivity.TheenzymeishighlypurifiedusingaproprietaryprocedurethatvirtuallyeliminatescontaminatingbacterialDNA.
Applications
- PCRandmultiplexPCRamplificationofDNAtemplates.
UnitDefinition:OneunitofMasterAmpTaqDNAPolymeraseconverts10nmolofdNTPsintoacid-insolublematerialin30minutesat70°Cunderstandardassayconditions.
StorageBuffer:50%glycerolcontaining50mMTris-HCl(pH7.5),100mMNaCl,0.1mMEDTA,0.5%Tween20,0.5%NP-40,and1mMDTT.
QualityControl:MasterAmpTaqDNAPolymeraseistestedfortheabsenceofdetectablenonspecificexo-andendonucleaseandRNaseactivities,andarefunctionallytestedinPCR.
*PurchaseofMasterAmp™TaqDNAPolymeraseincludesanimmunityfromsuitunderpatentsspecifiedintheproductinserttouseonlytheamountpurchasedforthepurchaser'sowninternalresearch.Nootherpatentrights(suchas5´NucleaseProcesspatentrights)areconveyedexpressly,byimplication,orbyestoppel.FurtherinformationonpurchasinglicensesmaybeobtainedbycontactingtheDirectorofLicensing,AppliedBiosystems,850LincolnCentreDrive,FosterCity,California94404,USA.Coveredbyissuedandpendingpatents.Forcompletelicensestatement,seep.iv.
**Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
ORDERINFORMATION
EachproductincludesMasterAmp™TaqDNAPolymerase,MasterAmpTaq10XPCRBuffer,MasterAmp10XPCREnhancer,and25mMMgCl2Solution.ebiomall.com






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在另外的一组管子中,加入已知拷贝数的DNA同时扩增,每个管子中加入的数量是不同的,但是从最小数目到最大数目的这个范围涵盖了样本中DNA拷贝数。
PCR反应完成后,把已知拷贝数DNA的量和PCR荧光Ct值制成标准曲线,再把待测样本的CT值和该标准曲线比对,就可以得到样本中的起始拷贝数了
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度(没有蛋白质和DNA的污染)以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法,它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱,通过图谱来反应RNA的量和完整性,其完整性通过完整性系数(RIN)来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA,4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性,因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法:采用GAPDH的3’:5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录,然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性,如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源:生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物,盐离子,尿素,血红素,heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系:
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种:
1.随机引物:随机引物,特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果,建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT:只能用于mRNA完整的样品,特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物:最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
荧光定量PCR较普通PCR不同的一点就是可以实时检测PCR扩增产物,从而可进行绝对定量或者相对定量。
国产的有上海宏石,枫岭,中山达安基因,上海科华生物,大约10-15万。
进口的有ABI公司的大约45万,罗氏诊断的大约40万,Bio-Rad的大约30万。
一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下:
对照组基因A的CT值为20, 内参(比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18,内参CT值14。
首先算加样量:delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍,所以4处以2=2,最后的相对量是2倍。
几点注意:
1。必须确定扩增的特异性
2。 只有相同目标的CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。 2的某次方只是理论值,实际扩增效率低于2。
4。 最好不用Syber Green
标准品的荧光强度和已知的浓度作图,可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后,就可以在标准曲线上算出样本浓度了。

