
Alpha TaqTM and Alpha TaqTM LA Mix are available as a ready-to-use 2X mixture of DNA polymerase, salts, magnesium and dNTPs for setting up a trouble-free PCR reaction and there is the choice of an inert green dye, used for direct gel loading. All you have to do is to add template, specific primers and water, thereby save time, effort and minimize pipetting error.
Alpha TaqTM and Alpha TaqTM LA Mix are recommended for all standard PCR applications. It is comprised of Alpha TaqTM or Alpha TaqTM LA DNA Polymerase (Click here) and a novel buffer system that deliver very high yield PCR amplification over a wide range of PCR templates. It has been developed to give more robust amplification than other commonly-used mixes, allowing it to perform well with challenging templates and for direct PCR without DNA purification.
Data Sheet: 2X Alpha TaqTM and Alpha TaqTM LA Mix
VitaNaviTechnolog是华盛顿大学BarnesWayne教授创办的一家专门从事Taq酶及其相关产品研发与销售的生物公司。BarnesWayne教授是国际上著名的Taq酶专家,也是长片段基因PCR扩增技术的发明人和专利所有人(1993,PNAS;U.S.Patent5,436,149)。20多年来,BarnesWayne教授始终致力于PCR聚合酶,研发了系列TaqDNA聚合酶产品,远销全球40多个国家,是目前国际上生产PCR聚合酶的主要供应商之一。美国VitaNaviTechnology公司研发的新型高耐受性DNA聚合酶为基因检测技术带来了根本性的革新,彻底解决了依赖于纯化的核酸DNA为模板进行PCR扩增这一瓶颈问题。 产品简介 Omni酶是从文库中筛选出来的具有极高耐受性的Taq或者Klentaq突变体,可以直接以全血、血清、土壤、牛奶、巧克力或奶酪等材料为模板一步扩增目的基因,避免了繁琐的核酸DNA提取过程 产品特征:1.对全血、血清、血浆、土壤、植物、巧克力、奶酪和牛奶中的抑制因子具极高的耐受性,可直接对样品进行PCR检测,无需DNA分离。2.可以耐受高达40%的全血,20%的血浆或血清。3.可以从人血液中一步扩增疟疾基因。4.Omni酶节省时间、降低成本.5.直接从微量样品中的扩增,避免样品提取而丢失或污染DNA。
一、Klentaq1/KlentaqLA?实例1:用KelntaqLA扩增大于20kb的大片段基因。??二、高耐受性(Inhibitor-Resistant)聚合酶:OmniTaq/OmniKlentaq产品特征:1.对全血、血清、血浆、土壤、植物、巧克力、奶酪和牛奶中的抑制因子具极高的耐受性,可直接对样品进行PCR检测,无需进行DNA分离纯化。2.可以耐受高达40%的全血,20%的血浆或血清,已应用于多种遗传病的分子诊断和临床检验。3.可用于法医、环境监测、农业、动植物检疫和临床诊断等领域。4.可以从人血液中一步扩增疟疾基因。5.与PCR增强剂结合使用时,其耐受性将进一步提高。6.使用Omni酶不仅节省时间、降低成本,而且实现了从微量样品中的扩增,避免因提取过程所致的DNA丢失或污染。实例2:用OmniTaq(OT)和OmniKlentaq(OKT)从肝素抗凝血液中一步扩增乙肝病毒基因。?实例3:用新突变的Omni酶从富含腐殖酸的人基因组中扩增1.1kb的CCR5基因。?实例4:用新突变的Omni酶从巧克力和黑胡椒中直接扩增基因。?三、热启动聚合酶(Hot-start)聚合酶:CesiumTaq/CesiumKlentaq产品特征:1.CesiumTaq和CesiumKlentaq是一种冷敏感的突变体,在室温条件下聚合酶的活性很低,当升高温度进入PCR循环时聚合酶的活性就全部释放出来,因而具有内置式热启动功能。2.与现有化学修饰或抗体封阻的热启动聚合酶相比,CesiumTaq和CesiumKlentaq的聚合酶活性更高,扩增效果更好。3.CesiumKlentaq具有热启动和高耐受性双重效果。实例5:用CesiumKlentaq扩增基因热启动效果比较?四、PCR增强剂(PCRenhancingcocktails,PEC)产品特征:1.联合使用PEC-1或PEC-2与高耐受性Taq酶(OmniTaqandOmniKlentaq)可以更好的克服样品中各种物质对PCR反应的抑制作用,进一步提高PCR扩增效率,简化PCR操作流程提高。2.PEC有助于从基因组中扩增GC含量高达80%的基因。3.PEC也可用于qPCR(SYBR和Taqmanprobe)。4.新研发的PCR增强剂PEC-3andPEC-4有助于从食品中扩增基因。?实例6:联合使用OmniTaqorOmniKlentaq及PCR增强剂(PEC)从不同类型的牛奶中检测沙门氏杆菌Inv基因。??实例7:联合使用OmniTaqorOmniKlentaq及PCR增强剂(PEC)从人的基因组DNA或全血中直接扩增3个高GC含量的基因。?五、各种特异性一步PCR试剂盒VitaNaviTech公司开发了系列一步法PCR和qPCR试剂盒,可以直接从样品中扩增目的基因。1.DirectBloodPCRKit:从血液中直接扩增目的基因实例8:使用DirectBloodPCRKit从全血中一步扩增CCR5基因
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1.模板提取(一般为RNA):Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理水
2.模板浓度测定:分光光度计或NanoDrop
3.逆转录:逆转录试剂盒(或者一步法试剂盒),这一步可以用普通PCR做,也可以用水域做。
4.荧光定量PCR试剂:通常有用SYBR Green Mix做的,但是这里建议你用EvaGreen做,灵敏度和平行性都要好于SYBR Green,并且如果你那是ABI或者Stratagene的PCR如果用SYBR Green还需要加一步Rox很麻烦。
5.其他:除了以上的那些还需要离心管、PCR管或板(Axygen反应比较好)、移液枪等,暂时就想到这么多。
组织用Trizol法提取总RNA浓度、纯度都很好,但逆转录后跑PCR,CT值偏高,内参的在22-27之间,目的基因在30-36之间,不知道是怎么回事,如何来解决,求高手赐教。我用的Takara的试剂盒。
跑到还有半小时的时候,跳出一个对话框:“analysiscannotproceed:notenoughsamplesdefined”,最后做出来的结果有扩增曲线但是没有熔解曲线,请各位大神帮忙解释一下。
两步法,是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度,而且定量PCR的产物都很短,需要的时候都短,所以两步法更方便。三步法的话,花的时间长,不利于快速实验。
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度(没有蛋白质和DNA的污染)以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法,它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱,通过图谱来反应RNA的量和完整性,其完整性通过完整性系数(RIN)来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA,4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性,因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法:采用GAPDH的3’:5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录,然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性,如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源:生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物,盐离子,尿素,血红素,heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系:
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种:
1.随机引物:随机引物,特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果,建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT:只能用于mRNA完整的样品,特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物:最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
如果要测量细胞表面2个受体的比率,最好用流式细胞仪来测量

