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biopioneerinc/Blunt End PCR Cloning Kit without Competent Cells, 20 reactions/1/PCK-101
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4000-520-616
BP-Blunt TM Cloning Kit
For cloning PCR product generated with high fidelityDNA polymerase
Cat No. PKC-101 (without competent cells)
Cat No. PKC-102 (with competent cells)
Kit contents:
pBP-Blunt Vector (5-10 mg/ml) 20 ul
6X Reaction Solution50 ul
(1.2 M NaCl, 0.06 M MgCl2)
DH5 alpha Chemically Competent Cells 20 x 50 ul
Storage
pBP-Blunt Vector and X-Gal -20oC or lower
DH5alphaChemically Competent Cells -80oC
6X Reaction Solution4oC or lower
Protocol:
1. Thaw a vial of chemically competent cells on ice, and place S.O.C. medium at room temperature.
2. Warm up a 10 cm LB plus 100 ug/ml kanamycin agar plate to room temperature. Spread 40 ml of 40 mg/ml X-gal on the plate. Keep the plate at 37oC.
3. Set up the ligation reaction by adding the reagents in the following order:
PCR product 0.5-4 ul (containing 5-50 ng DNA)
6X Reaction Solution1 ul
Sterile wateradd to a final volume of 5 ul
pBP-Blunt Vector 1 ul
Total volume 6 ul
4. Mix the reaction gently and incubate at room temperature for 5 minutes. Then place the ligation reaction on ice.
5. Add 2 ul of the ligation reaction to the pre-thawed competent cells and mix gently. Avoid pipetting up and down.
6. Incubate on ice for 30 minutes.
7. Heat-shock the cells at 42oC for 30 seconds. Immediately place the cells on ice for 1-2 minutes.
8. Add 250 ul of room temperature S.O.C. to the cells. Cap the vial and shake it at 200 rpm, 37oC for 1 hour.
9. Spread 50-250 ul of the transformation on the pre-prepared LB agar plate.
10.Pick white colonies and grow them individually in a proper medium.
Note:
1.pBP-Blunt Vector can be used to clone PCR product from tens of bases to at least 5 kb .
2.PCR product must be generated with high fidelity DNA polymerase, and thus the PCR product has blunt ends. For best results, do not use DNA polymerase reagent containing Taq DNA polymerase.
3.PCR primers for PCR reaction must not have 5’ phosphate.
4.pBP-Blunt Vector contains the lacZ-a fragment gene. In the presence of X-gal, the transformants are blue. When inserted into the vector, PCR product will disrupt the expression of lacZ-a fragment and the transformants are white.
5.For best results, PCR product shorter than 2 kb should be column-purified to remove primers and primer-dimers. If longer than 2 kb, it should be gel-purified. Adding PCR product directly to the ligation reaction without purification will increase the background colony number, and thus blue/white screening is essential.
6.If PCR product is copied from a plasmid containing a kanamycin resistant gene, treat the PCR product with Dpn I before purification to destroy the template.
7.For best cloning results, PCR product should be freshly prepared.
Technical information:
The flanking sequences of the cloning sites:
Kpn ISac I BamH I BamH I EcoR V
1caagcttggt accgagctcg gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaattgCccc Tt PCRaagggGcaatt cGGATCCgat atccatcaca
GTTcgAACCA TGGCTCGAGC CTAGGTGATC ATTGCCGGCG GTCACACGAC CTTAACGGGG AA PRODUCTT TCCCcGTTAA GCCTAGGCTA TAGGTAGTGT
Not I T7 Promoter
94 CTggcggccgct cgagcatgca GCTCGTACGTtctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattac
GACCGCCGGCGA GCTCGTACGT CGAGCATGCA AGATCTCCCG GGTTAAGCGG GATATCACTC AGCATAATG
Topoisomerase site 162
Topoisomerase site 263
T7 promoter (c)137-153
T7 primer134-153
M13 (-20) forward primer161-176
M13 (-40 forward primer 180-196
f1 origin 317-755
Kan promoter 951-1088
Kanamycin resistant gene 1089-1883
pUC origin2562-3235
lac promoter 3452-3573
lac repressor binding site3536-3556
M13 reverse primer3562-3578
(c) = complementary strand
Trouble shooting:
Problem | Possible cause | Solution |
Few or no colonies, but a positive control plasmid yielded normal number of colonies | Did not use high fidelity DNA polymerase in PCR. | Perform PCR with high fidelity DNA polymerase. |
PCR primers have 5" phosphate. | Do not use 5" phosphorylated primers in PCR. | |
Few or no colonies and even a positive control plasmid did not yield a normal number of colonies | Competent cells have low transformation efficiency. | Us fresh competent cells with a transformation efficiency > 108/mg pUC19 for transformation. |
Few white colonies and most of the colonies had a blue spot in the middle | Too much primers or primer-dimers present in the ligation reaction. | Purify PCR product to remove primers and primer-dimers. |
Few colonies containing the correct PCR product | Too many nonspecific PCR products in the ligation reaction. | Gel-purify the expected DNA band from PCR product. |
Biopioneer Brand:
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运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
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2017-07-26
定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法... 查看更多
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The molecular events that lead to the perception of pain are a key research field in medicine and drug discovery. The opioid receptors modulate pain signaling 查看更多
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ABI7000定量PCR仪,ABIPrism7000是由上海朗赋实业有限公司代理或销售的0品牌的仪器，产品来源于美国。上海朗赋实业有限公司是中国最权威的ABI7000定量PCR仪,ABIPrism7000销售服务商之一，在上海等地方销售ABI7000定量PCR仪,ABIPrism7000已经多年。同时，生物在线为您提供众多企业ABI7000定量PCR仪,ABIPrism7000仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的ABI7000定量PCR仪,ABIPrism7000产品 查看更多
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2021-08-23
枫岭国际有限公司在发布的实时荧光定量PCR仪（Smart-Q）供应信息，浏览与实时荧光定量PCR仪（Smart-Q）相关的产品或在搜索更多与实时荧光定量PCR仪（Smart-Q）相关的内容。 查看更多
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2021-07-17
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法，在这里主要介绍这2种方法，其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。... 查看更多
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2017-07-26
定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法... 查看更多
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2018-08-03
南京诺唯赞生物科技有限公司在发布的【正品直销，售后保障】(Vazyme染料法荧光定量PCR预混液）AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix 供应信息，浏览与【正品直销，售后保障】(Vazyme染料法荧光定量PCR预混液）AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix 相关的产品或在搜索更多与【正品直销，售后保障】(Vazyme染料法荧光定量PCR预混液）AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix 相关的内容。 查看更多
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2018-12-26
One of responses to increased blood pressure is cardiac hypertrophy through increased size of ventricular myocardial cells leading to increased thickness of th 查看更多
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2018-08-15
美国伯乐CFX384荧光定量PCR仪是由上海朗赋实业有限公司代理或销售的0品牌的仪器，产品来源于美国。上海朗赋实业有限公司是中国最权威的美国伯乐CFX384荧光定量PCR仪销售服务商之一，在上海等地方销售美国伯乐CFX384荧光定量PCR仪已经多年。同时，生物在线为您提供众多企业美国伯乐CFX384荧光定量PCR仪仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的美国伯乐CFX384荧光定量PCR仪产品 查看更多
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2018-12-19
Rotor-GeneTM6000荧光实时定量PCR仪 全世界温度均一性*好，温度分辨率*高的定量PCR仪。它不仅仅是一台定量PCR，更是*高分辨率的HRM遗传分析系统。是同行业内荣获*高奖项和评价“Frost & Sullivan奖”的定量PCR仪。l 「温度均一性*佳的荧光定量分析系统」——Rotor-Gene 6000实时荧光定量分析系统。独特的离心式设计和精密的温度管理将样品 查看更多
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2017-07-13
上海康成生物工程有限公司在发布的LncRNA实时定量PCR技术服务供应信息，浏览与LncRNA实时定量PCR技术服务相关的产品或在搜索更多与LncRNA实时定量PCR技术服务相关的内容。 查看更多
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2018-07-16
新年新气象，金鸡送福利，2017鸡年“鸡”及向上，然泰携手本公司实验室全体技术服务专业人士，新年大回馈，意想不到的折扣，意想不到的惊喜，还在等什么，为自己的实验室的研究工作置办一次不一样的年货吧! 关于实验室技术服务，上海然泰价格优惠、品种齐全、服务周到，你想要的，我们一定备好产品，尽我们努力的可能说到做到，让你能放心准备自己手头的实验。 酶联免疫(ELISA)技术服务 上海然泰公司——依托复旦大学，集研发、销售、实验室技术服务于一体 查看更多
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荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制123
逍遥PVej32017-10-03
用已知浓度的DNA样本（通常是质粒）梯度稀释成一系列的样本。做实验的时候，这些标准品和待测样本加在同样一块96孔盘的不同孔内。一起做PCR。
标准品的荧光强度和已知的浓度作图，可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后，就可以在标准曲线上算出样本浓度了。
标准品的荧光强度和已知的浓度作图，可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后，就可以在标准曲线上算出样本浓度了。
pcr ct值越高是否说明表达越低,ct值越高说明表达也低,是吗？最后结...123
hnrtn4aO932017-10-03
所谓Ct值，就是最先出现超过阈值信号的那个循环数。或者说是到了第几个循环才出现超过阈值的信号。
C代表的是cycle，循环数目，T代表的是threshold,阈值。
所以表达量越少的话，需要越多的循环才能扩增出来。也就是CT值越高
C代表的是cycle，循环数目，T代表的是threshold,阈值。
所以表达量越少的话，需要越多的循环才能扩增出来。也就是CT值越高
热启动酶的原理与应用 123
夏忻赣鬃22017-10-01
第代热启Taq酶种DNA聚合酶 第代指直接Taq（种细菌）体内提取聚合酶没进行化修饰达更聚合催化效往往需要经酶工程处理聚合酶催化效率更高 热启指种酶反应温度条件该...5715
Taq聚合酶 123
嘟嘴伦02662017-10-03
Taq酶水栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）离具热稳定性DNA聚合酶般用Taq酶rTaq酶LTaq酶两类LTaq酶保真性更强耐热性比rTaq酶图" class="ikqb_img_alink">
Taq DNA聚合酶使用说明书123
姆姆EH172017-10-03
1单位（U）Taq DNA 聚合酶力定义74°C、30钟内性化马哈鱼精DNA作模板/引物10nmol脱氧核苷酸掺入酸容物质所需酶量图" class="ikqb_img_alink">
解答使用荧光定量pcr仪时的常见问题123
shiqinghuayi12021-07-25
第一次做这方面的实验，这张图的右半个不会选，希望大家帮帮忙
荧光定量PCR与普通PCR相比有哪些不同?.生意经求助 123
布美男00182021-08-20
荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同：荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光；普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量，一般是紫外光。反应要求：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通pcr必须电泳。结果：荧光定量可以实现精确定量，普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量，后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点，机会好的话，设计一对引物就能得到很好的结果，机会不好的话7、8对引物也出不来，我就遇到过这样的问题，我在prime5.0上设计了8对引物，符合实验要求的一对也没有，我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定，后来我想通了，可能我这对引物把其它序列扩增出来了，而且扩增效率很高（我一个同学设计了十几对才找到一对好用的）。记住primer5.0设计出来的100%好的引物，到了定量PCR上不一定好使，这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高，我现在使用的引物就有几个碱基不匹配，但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎，直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件，你只要找好你目的基因的种属，输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处，他会自动地把你的种属序列背景扣除，最大限度地去除引物二聚体产生的可以。
荧光定量PCR中,起始拷贝数是什么?怎么来的?123
天空飘飞的云2021-08-16
这个指的就是样本中原有目标DNA的数量。
在另外的一组管子中，加入已知拷贝数的DNA同时扩增，每个管子中加入的数量是不同的，但是从最小数目到最大数目的这个范围涵盖了样本中DNA拷贝数。
PCR反应完成后，把已知拷贝数DNA的量和PCR荧光Ct值制成标准曲线，再把待测样本的CT值和该标准曲线比对，就可以得到样本中的起始拷贝数了
在另外的一组管子中，加入已知拷贝数的DNA同时扩增，每个管子中加入的数量是不同的，但是从最小数目到最大数目的这个范围涵盖了样本中DNA拷贝数。
PCR反应完成后，把已知拷贝数DNA的量和PCR荧光Ct值制成标准曲线，再把待测样本的CT值和该标准曲线比对，就可以得到样本中的起始拷贝数了
乙肝荧光定量pcr检测要多少钱_即问即答_家庭医生在线即问即答123
136328440802021-08-10
定量检测包括总RNA提取和纯化、（可能还需要做mRNA提取和纯化）、RT、定量PCR
还需要反转录用的引物、定量PCR用的一对引物、荧光信号源（荧光染料或荧光标记的探针，看你用什么策略来做定量PCR）
报价要看你需要服务商提供什么服务，如果你只提供实验材料，要求服务商做以上全部工作，只检测一个指标（一个基因的表达水平变化），价格大约每个样品350-500元，多一个指标大约多90元。
一般至少做一组数据两个样品嘛，所以你按1000块一组样品预算吧。
还需要反转录用的引物、定量PCR用的一对引物、荧光信号源（荧光染料或荧光标记的探针，看你用什么策略来做定量PCR）
报价要看你需要服务商提供什么服务，如果你只提供实验材料，要求服务商做以上全部工作，只检测一个指标（一个基因的表达水平变化），价格大约每个样品350-500元，多一个指标大约多90元。
一般至少做一组数据两个样品嘛，所以你按1000块一组样品预算吧。
定量PCR方法及数据分析123
有木有3803722021-08-06
你所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reversetranscription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtimefluores-cencequantitativePCR）也简称RT-PCR，但是我觉得这是不对的，不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。实时荧光定量PCR也就是Real-TimePCR，原理有点多，请自行百度百科，其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到。例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异，首先你要提取2个组织的总RNA，然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达，然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。
荧光定量PCR123
2017-10-03
这几天一岁的闺女得手足口病，医院让查这个，荧光定量是查什么的？有什么用啊？尽量说的直白一点，完全不懂啊！
荧光定量pcr三步法反应条件怎么设置_问答详情_分子诊断_分子类_...123
黎约践踏29972017-10-03
三步法PCR 首先95°C 作用3 min。 PCR 进行 35 个循环。 步骤 温度 变性 95°C 退火 58°C 延伸 72°C 时间 30 秒 30 秒 30 秒 融解曲线 温度 时间 变温速度 95°C 0秒 20°C/秒 55°C 15 秒 20°C/秒 95°C 0秒 0.1°C/秒 PCR 疑难解答 当 PCR 结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 1 将 PCR 反应的试管与反应板紧贴。 2 当酶反应混合物以 70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍 3 微振荡一 下，因为在 0.2-ml 的 PCR 管中不能均匀传热。 4 不要随意减少 dNTP 的用量， 它是一个系统的因素， 必须与其它成份保持平衡。
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