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제품특징
□ 제품 설명
Tris Buffered Saline(TBS)는 ELISA나 Western Blotting, 면역 조직 염색실험에 대해 일반적으로 자주 사용되는 버퍼이다. Tris Buffered Saline (TBS) Tablets, pH7.6은 물에 녹이는 것만으로 간편하게 TBS를 조제할 수 있고, 1정으로 500 ml의 TBS (pH7.6)이 조제할 수 있다. Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBS-T)은 blocking 작용을 할 수 있는 비이온성 계면활성제 Tween 20을 포함한 TBS이다. Western Blotting과 ELISA실험에 사용할 수 있으며, 항체 희석이나 washing buffer, blocking buffer로 사용된다.Tris Buffered Saline with Tween20 (TBS-T), pH7.6은 물에 녹이는 것만으로 간편하게 TBS-T buffer를 조제할 수 있고, 1정으로 500 ml의 TBS-T buffer (pH7.6)를 조제할 수 있다.
□ 내용
100 tablets (50 L)
□ 보존
실온, 건조 상태로 보존
□ 규격
Tris-Buffefed Saline (TBS) Tablets pH7.6 (Code T9141)
● Format: Tablets(정제)
● 최종농도: 0.05 M Tris-Hcl, 0.15 M NaCl
● Volume: 용량(1정) 500 ml
● pH: 7.6 ± 0.1 at 25℃
Tris-Buffefed Saline with Tween 20 (TBS-T) Tablets pH7.6 (Code T9142)
● Format: Tablets(정제)
● 최종농도: 0.15 M Tris-Hcl, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20
● Volume: 용량(1정) 500 ml
● pH: 7.6 ± 0.1 at 25℃
□ 조제법
플라스크 또는 비커에 200 ml의 증류수 와 tablet 1정을 넣고 녹인 후, 전량을 500 ml에 조정한다.
□ 용도
Tris Buffered Saline (TBS) Tablets, pH7.6 (Code T9141)
● ELISA, Western Blotting, 면역 조직 염색시 washing buffer
● 샘플 희석
Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBS-T) Tablets, pH7.6 (Code T9142)
● ELISA, Western Blotting 에 있어서의 washing buffer 혹은 blocking buffer
● 항체 희석
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1.模板提取(一般为RNA):Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理水
2.模板浓度测定:分光光度计或NanoDrop
3.逆转录:逆转录试剂盒(或者一步法试剂盒),这一步可以用普通PCR做,也可以用水域做。
4.荧光定量PCR试剂:通常有用SYBR Green Mix做的,但是这里建议你用EvaGreen做,灵敏度和平行性都要好于SYBR Green,并且如果你那是ABI或者Stratagene的PCR如果用SYBR Green还需要加一步Rox很麻烦。
5.其他:除了以上的那些还需要离心管、PCR管或板(Axygen反应比较好)、移液枪等,暂时就想到这么多。
组织用Trizol法提取总RNA浓度、纯度都很好,但逆转录后跑PCR,CT值偏高,内参的在22-27之间,目的基因在30-36之间,不知道是怎么回事,如何来解决,求高手赐教。我用的Takara的试剂盒。
跑到还有半小时的时候,跳出一个对话框:“analysiscannotproceed:notenoughsamplesdefined”,最后做出来的结果有扩增曲线但是没有熔解曲线,请各位大神帮忙解释一下。
两步法,是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度,而且定量PCR的产物都很短,需要的时候都短,所以两步法更方便。三步法的话,花的时间长,不利于快速实验。
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度(没有蛋白质和DNA的污染)以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法,它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱,通过图谱来反应RNA的量和完整性,其完整性通过完整性系数(RIN)来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA,4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性,因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法:采用GAPDH的3’:5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录,然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性,如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源:生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物,盐离子,尿素,血红素,heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系:
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种:
1.随机引物:随机引物,特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果,建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT:只能用于mRNA完整的样品,特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物:最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
如果要测量细胞表面2个受体的比率,最好用流式细胞仪来测量

