1导言 小RNA(miRNAs)是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA,它们是许多基础的细胞过程中基因表达的主要调节因子,这些过程包括细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡等。miRNA在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说,miRNA通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的调控。然而,在靶向mRNA降解水平上的基因表达的调控已有报道。因此,有证据显示miRNA能够通过RNA降解来实现对细胞内mRNA浓度的直接调控,而且也会通过靶向作用于蛋白质级联来调控mRNA水平,这些蛋白质级联能够调控下游转录或在转录后对mRNA水平进行调控。 在当前的研究中,我们重点关注miRNAhsa(人)miR-21,研究发现在乳腺癌和其他肿瘤中miR-21水平上调。更进一步的研究发现,miR-21在细胞凋亡和细胞生长过程中也发挥着功能性作用。为了进一步对miR-21进行研究,我们研究了miR-21的水平对三个假定的miR-21靶向基因(PDCD4,PTEN和TLR2)mRNA表达的影响(见图1)。 图1:利用假定的miR-21靶向基因(PDCD4,PTEN和TLR2)的表达水平分析从而对hasmiR21进行分析的工作流程。 2材料和方法 DMEM培养基中补充1%的L-谷氨酰胺,1%的盘尼西林/链霉素,10%的FBS,在+37℃5%CO2条件下培养HeLa细胞。用miRNA21miRIDIAN类似物,miRNA类似物miRIDIAN对照,miRNA21miRIDIAN抑制剂和miRNAmiRIDIAN抑制剂对照siRNA(dhar-macon都为50nM),以及X-tremeGENEsiRNA转染试剂(罗氏公司),按照生产商的方案进行转染。 RNA提取与逆转录 在转染之后两天,使用HighPureRNAIsolationKit(罗氏公司),按照生产商的建议从HeLa细胞中提取总RNA(每个类似物miRNA三个生物学复制)。同时,使用HighPuremiRNAIsolationKit(罗氏公司),按照使用说明书上的指导,提取包含小分子量RNA在内的总RNA(两个生物学重复)(见图2)。按照生产商的指导,使用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit(罗氏公司)和oligo(dT)18与随机六聚体引物的混合物,按照每次反应500到1000ng总RNA的量进行第一链cDNA的合成。用miRCURYLNAFirst-strandcDNAKit(Exiqon)进行miRNA第一链cDNA的合成,每次反应使用4ng含有小RNA在内的总RNA。 图2:用指定试剂(miRIDIANmiRNA类似物或miRIDIANmiRNA抑制剂)转染HeLa细胞后,用Agilent生物分析仪对来自不同细胞集群的小分子量RNA进行凝胶电泳。 [1][2]下一页 地址:上海市申长路900号虹桥天地2号楼8楼联系人:罗氏生命科学电话:021-33971000传真:021-33971888Email:china.lifescience@roche.com