Highqualitydeoxynucleotidetriphosphate(dNTPs)arefunctionallytestedinlongPCRtobePCRqualified,andmeetorexceedthecriteriaforhigh-qualitysequencingwithThermoSequenaseDNApolymerase.
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1）PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平
2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.
3）首先是你的TAQ酶要在冰上操作，以免失活（Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果），TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱，注意不要污染，PCR完成后要及时从PCR仪取出（如果你的PCR仪没有保温功能），如果你放在外面时间较长可以放－20度冰箱（尤其片段比较小时）。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.
一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,
4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度
PCR实验中出现的问题及对策：
一、非特异性条带
原因：1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染
对策：1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品
具体措施:
1、Primer浓度过高，建议以0.1uM间隔递减
2、酶量过多，建议0.5U间隔递减
3、循环次数过多，建议2个循环间隔递减
4、Anneal温度过低，以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度，范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件，很难摸出时可以使用降落PCR，普通的9600PCR仪也可以做，只是程序麻烦些。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
5、采用Hotstart法或Coolstart法，减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加，当然可以做个简易冰盒，直接在94度放入样本到机器，效果不错。
6、Template量过多，Template量以20%递减。PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。
7、Extension时间过短，30s间隔递增。
二、带微弱
1.出现的现象：扩增带时有时无，出现时与国外文献中的照片相似，不出现是则看不到或者非常弱。
2.曾用的解决方法：换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果（虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果，但实在是万般无奈），把各引物单独或者两两结合进行试验，时好是坏。
3.思考：第一点，是否是管子的问题？管子的质量不是很好（为了便宜），特别是外形不是很规矩，与扩增仪上的管孔结合不紧密，又不经常加油，而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢？第二点，那么是否是变性温度较高使酶过早的失活？虽然扩增的产物很弱，但分子量是相符的，说明扩增在进行，只是产物量较少，这可能与Taq酶的活性有关.
4.最后解决：将变性温度由文献的95℃改为94℃，问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。
三、设立对照
设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用重新处理样品。
设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。
空白对照：加的是“水”——出现“区带”
待检样品：加的是“模板”——无“带”
说明：1，水被污染
2，模板阴性
四、遇到意外继续实验
PCR体系遇到停电就放在4度1天，还可以扩出来，意外时不要扔还可以做一次啊
PCR操作注意点
1、写好试剂标签
1）对于需要存放的试剂、样品，都有明确的标签，套小的密实袋，离心管上有品名、浓度、日期，在密实袋上会重复写一次；
2）实验记录上还会记下新来试剂的存放日期；
3）用成品试剂盒时，除了会在实验记录上记下某日用量多少，还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。
2、管子放置
做大批量PCR用八连管，八连管的盖子有一端有缺口，有缺口的那段向着自己，有时碰到盖好后没有拿稳掉下来，也能准确无误的分清楚前后次序。
3、准备工作
实验之前，试剂器皿仪器都准备妥当，且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查，确认无误后，就快速准确的动手实验。
1）酶和dNTP最好分装．
dNTP的质量与浓度: dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
2）PCR前，将枪等物品放在超净台中，用紫外照射半小时，可以破坏DNA，防止气溶胶污染等。但是，PCR不一定非要在超净台进行，如做质粒PCR就不那么严格．
3）PCR时，试剂化冻后，都稍稍振荡（手弹或者颠倒混匀），离心后再取（通常几秒钟，当转速到2000转左右关离心机）。（1）较均匀；（2）盖上沾的试剂被离下，不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前，混匀的时间要稍长些。
4）PCR反应体系需要在冰上进行配制，以免酶失活或者核酸降解，反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。
5)，两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.
4、预热PCR仪
上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键，先设置好PCR的程序然后再去配体系，别配好体系才想起PCR仪还没开。
5、加样：
1》、加样顺序
1）按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶－水这个顺序加,不易起泡.
2）或加样顺序倒没有特别要求，只是Taq酶要注意最后加，加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.
3）或珍贵的、易引起污染的物质先加。
比如1、如果样品DNA很稀少，很宝贵，避免DNA间的污染就要首先考虑：第一步先加水，第二步就紧接着加DNA，这样加相同DNA就可以不换TIPS，又不会在DNA中污染引物等其他东西。
比如2、如果用随机引物，缓冲体系和酶就要重点保护？？？，先加它们再加引物和模板。
比如3、如果用的酶有外切活性，如PyroBest，pfu，就必需把酶放到最后加，否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。
2》、混合加样
若做多管的PCR，可先加一起，再用枪分取
比如要做n管，就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好，然后再分装，如：
10xbuffer5ul
dNTP4ul
引物11ul
引物21ul
taq酶1ul
ddw34ul
模板2ul
共有9个模板，就把除模板外的其他成分乘10，即buffer50ul，dNTP40ul，引物110ul，引物210ul，taq酶10ul，ddw340ul，加到一个离心管中，加盖，用力振荡使混匀（这步是必要的，否则分到各管中的体系不均匀），稍稍离心一下，然后分装至9个PCR管中，每管48ul，再依次加入模板2ul，混匀，稍稍离心，上机
3》、保证把微量的反应物加进去
1）枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多)，若看见有一个小水滴掉进去，证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加，可能加进空气。所有的试剂都加完后，要用枪混匀，然后用手动离心机离一下，使之没有气泡，不要用手剧烈震荡tube
2）枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心)，否则使某些物质的量减少，所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法，也就是加样时沿着管壁螺旋式上升，等全部加完后离心混匀，如果有气泡，用手指轻轻弹几下，气泡就没了（有时ep管内有气泡，反正p时要加温，发现最后结果相差不大），而且确保液体都在管底。
3）在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时，加在管壁，而不是管底，在管壁形成一个小液滴，每个小液滴都孤立存在，用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!
4》、避免漏加或重复加
1）事先列出清单，准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。
2）少量加样时，可以把试剂分别先加到EP管壁，这样不仅可以确定是否加上了试剂，还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确；
3）加样时，将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧，加完的转移到另一侧。
4）将PCR试剂放在最右边的竖排，再将EP管从左边开始横排放，在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排，这样就可以清楚的区分哪些管加了
5）还有如没有太大影响的话，将加完的合上盖子，没加的盖子打开。
6）泡沫（软的那种）制作了个板子，把ep管放上去，在加样时用枪尖压下
5》、准确浓度：
1）试剂完全化后再加样，浓度准确。像镁离子，融化后最后用枪头再吹打完全混匀。
2）各种酶，用之前瞬时离心一下，如果买的大包装的，最好分装一下，以避免反复冻融。
3）试剂用之前瞬时离心一下.
6》、注意枪头和枪是否结合紧密，否则误差将会很大；
7》、枪头：枪头要买好的，不然你有好枪也没用。
目前各家仪器公司推出自己的数字PCR，目前市场主流的是三家，1、LIFETechnologies3D数字PCR（芯片式数字PCR）：我个人认为是微孔数字PCR，主要是将20ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应,变成20000个反应体系，PCR反应结束后，采用CCD拍照，数阳性反应孔。2、Bio-Rad的微滴数字PCR（油包水原理）：将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系，PCR反应结束后，才有流式细胞术的原理，检测每一个液体，数阳性反应的液滴数量。3、RainDance的数字PCR（油包水原理）、原理与伯乐微滴数字PCR相同，但是其液体形成能力比伯乐强很多，理论上可以产生1000万个小油滴。价格从高到底：Raindance、Bio-Rad、LIFETechnologies。目前本人使用的是Bio-RadQX200、正在做实验室，希望广数字PCR的使用者可以相互交流，相互解答疑问，更好的利用数字PCR。
在科学研究中细胞培养等技术已是相当成熟，可对细胞的状态完全无保留的呈现给研究者是一直以来的难点。不过，现在一种新的成像技术的出现，给研究者们带来了曙光，那就是全息成像技术，前期这种技术大多应用在摄影方面，目前瑞典Phiab公司采用这种全息技术新开发出HoloMonitorTMM4激光全息成像及分析系统，成功将这种高新技术应用到生命科学领域。
那这位新晋之主能为我们带来哪些惊喜呢？
1，长期、非侵入性细胞检测
M4是采用物理干涉成像技术，实现了对细胞非侵入、无标记性的观察，最大程度地体现细胞的真实状态，并可以排除实验处理的假阳性。在系统的分析软件中，可以对观察细胞实现3D重建，并对图片添加伪彩，增加细胞与背景的对比度，让你实验图片焕然多彩，不再只是黑或白。
2，细胞追踪
M4可以对细胞进行长时间延时拍摄，实现细胞边培养边拍摄，自动记录细胞的运动性。目前在许多科学研究中，细胞运动性，细胞迁移率是判断细胞敏感性的重要指标，在M4系统中不仅可以获得细胞长时间的形态上的直观图片，同时，分析软件中的Trackcells可以给予单细胞，多细胞的运动轨迹，迁移方向，迁移距离等多种数据，避免了你在实验之后的数据统计和数据分析过程，真可谓是省时省力。
3，数量统计
M4分析系统中采用细胞分割识别的方法，可以进行多种统计方法的细胞识别。（也可以进行手动调节哦！）根据采集图像区域与培养皿体积的相关性，对整个培养皿的细胞数量进行统计。除此之外，系统会自动生成任一细胞参数的数量统计柱形图，比如细胞体积的柱状图即不同细胞体积下的细胞数量分布。
4，形态学分析
形态学分析是M4系统中相当强大的功能。无论是实时成像还是延时成像，对图片中每个细胞的各个形态参数都有记录，如：体积、面积、最大厚度、平均厚度、周长、不规则度等。软件中Analyzecell可以对细胞参数之间的相互关系及细胞的分布情况直接输出散点图，研究者同时可以对散点图进行标记，记录实验所需的实验分析区域。并对每个区域又仅进行细胞形态学及统计学分析。该功能对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等领域有很好的应用。
5，数据输出
M4不仅可以输出图片也可以对延时拍摄图片制作成视频进行输出，更加直观的对细胞形态及细胞活动进行观察，为你的科研汇报更添佐证。
HoloMonitorTMM4激光全息成像及分析系统利用全息技术将细胞的每个点都几录下来，每个全息图中包含了图像中的全部数据，对于科研要求越来越严格的研究人员来讲，这无疑是细胞生物学的一个新的里程碑。
HoloMonitorTMM4激光全息成像及分析系统已经应用到了许多生命科学研究方面，如肿瘤侵袭与转移、细胞耐药性、纳米微阵列、混合纳米聚合物胶束、细胞周期、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、神经细胞观察等。目前研究者仍在挖掘M4的更多技术，更多应用、更多创新。
其中分离度和柱效是二个最重要、也更具有实用意义的参数。分离度是判断两物质在一个方法中分离的程度，虽然与柱效相关，但在衡量系统适用性时，首先强调的应该是分离度，只有当色谱图中仅有一个色谱峰或测定微量成分时，规定柱效才有其特殊重要性。重复性和拖尾因子，分别对重现性和色谱峰的峰形做出了要求。重现性保证了方法的可重复性，对柱效能提出了要求，柱子老化、塌陷，拖尾因子则难以达到要求
数字PCR 和色谱分析系统及中高压层析系统提醒你：
色谱分析以分离出来时间位置来判断是何种物质，以峰的积分面积来分析其含量。色谱分析法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。 ---即是一种分析方法
色谱分析系统，是基于色谱分析法的一种分析仪器，如：液相色谱、气相色谱、离子色谱、凝胶色谱等。
