Gene expression analysis to screen for pluripotency of embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells is streamlined and efficient with PrimerArray embryonic stem cell arrays. These arrays include primers for key markers of mouse or human ES cell pluripotency as determined by the International Stem Cell Initiative International (ISCI). When performing gene expression analysis by real-time RT-PCR, these ready-to-use primer sets save time, minimize pipetting, and reduce error.
Gene expression analysis to screen for pluripotency of embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells is streamlined and efficient with PrimerArray embryonic stem cell arrays. These arrays include primers for key markers of mouse or human ES cell pluripotency as determined by the International Stem Cell Initiative International (ISCI). When performing gene expression analysis by real-time RT-PCR, these ready-to-use primer sets save time, minimize pipetting, and reduce error.
Each PrimerArray embryonic stem cell array contains 96 primer pairs representing 88 genes associated with embryonic stem cell or iPS cell pluripotency and eight housekeeping genes. The PrimerArray Analysis Tool for Embryonic Stem Cells (available for download here)and/or Multiplate RQ (for use with the Thermal Cycler Dice Real Time Systems, not available in all geographic locations) are useful for analyzing data obtained using these products.
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1)PCR模板是关键,引物可以优化。制备模板的时候,一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入,同时还要注意添加模板的量,模板很理想的话,不用加太多,加的多了,混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平
2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.
3)首先是你的TAQ酶要在冰上操作,以免失活(Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果),TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱,注意不要污染,PCR完成后要及时从PCR仪取出(如果你的PCR仪没有保温功能),如果你放在外面时间较长可以放-20度冰箱(尤其片段比较小时)。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.
一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,
4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性,一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整,同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度
PCR实验中出现的问题及对策:
一、非特异性条带
原因:1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染
对策:1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品
具体措施:
1、Primer浓度过高,建议以0.1uM间隔递减
2、酶量过多,建议0.5U间隔递减
3、循环次数过多,建议2个循环间隔递减
4、Anneal温度过低,以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度,范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件,很难摸出时可以使用降落PCR,普通的9600PCR仪也可以做,只是程序麻烦些。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
5、采用Hotstart法或Coolstart法,减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加,当然可以做个简易冰盒,直接在94度放入样本到机器,效果不错。
6、Template量过多,Template量以20%递减。PCR模板是关键,引物可以优化。制备模板的时候,一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入,同时还要注意添加模板的量,模板很理想的话,不用加太多,加的多了,混进去的杂质机会就多了。
7、Extension时间过短,30s间隔递增。
二、带微弱
1.出现的现象:扩增带时有时无,出现时与国外文献中的照片相似,不出现是则看不到或者非常弱。
2.曾用的解决方法:换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果(虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果,但实在是万般无奈),把各引物单独或者两两结合进行试验,时好是坏。
3.思考:第一点,是否是管子的问题?管子的质量不是很好(为了便宜),特别是外形不是很规矩,与扩增仪上的管孔结合不紧密,又不经常加油,而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢?第二点,那么是否是变性温度较高使酶过早的失活?虽然扩增的产物很弱,但分子量是相符的,说明扩增在进行,只是产物量较少,这可能与Taq酶的活性有关.
4.最后解决:将变性温度由文献的95℃改为94℃,问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。
三、设立对照
设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用重新处理样品。
设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。
空白对照:加的是“水”——出现“区带”
待检样品:加的是“模板”——无“带”
说明:1,水被污染
2,模板阴性
四、遇到意外继续实验
PCR体系遇到停电就放在4度1天,还可以扩出来,意外时不要扔还可以做一次啊
PCR操作注意点
1、写好试剂标签
1)对于需要存放的试剂、样品,都有明确的标签,套小的密实袋,离心管上有品名、浓度、日期,在密实袋上会重复写一次;
2)实验记录上还会记下新来试剂的存放日期;
3)用成品试剂盒时,除了会在实验记录上记下某日用量多少,还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。
2、管子放置
做大批量PCR用八连管,八连管的盖子有一端有缺口,有缺口的那段向着自己,有时碰到盖好后没有拿稳掉下来,也能准确无误的分清楚前后次序。
3、准备工作
实验之前,试剂器皿仪器都准备妥当,且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查,确认无误后,就快速准确的动手实验。
1)酶和dNTP最好分装.
dNTP的质量与浓度: dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
2)PCR前,将枪等物品放在超净台中,用紫外照射半小时,可以破坏DNA,防止气溶胶污染等。但是,PCR不一定非要在超净台进行,如做质粒PCR就不那么严格.
3)PCR时,试剂化冻后,都稍稍振荡(手弹或者颠倒混匀),离心后再取(通常几秒钟,当转速到2000转左右关离心机)。(1)较均匀;(2)盖上沾的试剂被离下,不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前,混匀的时间要稍长些。
4)PCR反应体系需要在冰上进行配制,以免酶失活或者核酸降解,反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。
5),两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.
4、预热PCR仪
上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键,先设置好PCR的程序然后再去配体系,别配好体系才想起PCR仪还没开。
5、加样:
1》、加样顺序
1)按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶-水这个顺序加,不易起泡.
2)或加样顺序倒没有特别要求,只是Taq酶要注意最后加,加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.
3)或珍贵的、易引起污染的物质先加。
比如1、如果样品DNA很稀少,很宝贵,避免DNA间的污染就要首先考虑:第一步先加水,第二步就紧接着加DNA,这样加相同DNA就可以不换TIPS,又不会在DNA中污染引物等其他东西。
比如2、如果用随机引物,缓冲体系和酶就要重点保护???,先加它们再加引物和模板。
比如3、如果用的酶有外切活性,如PyroBest,pfu,就必需把酶放到最后加,否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。
2》、混合加样
若做多管的PCR,可先加一起,再用枪分取
比如要做n管,就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好,然后再分装,如:
10xbuffer5ul
dNTP4ul
引物11ul
引物21ul
taq酶1ul
ddw34ul
模板2ul
共有9个模板,就把除模板外的其他成分乘10,即buffer50ul,dNTP40ul,引物110ul,引物210ul,taq酶10ul,ddw340ul,加到一个离心管中,加盖,用力振荡使混匀(这步是必要的,否则分到各管中的体系不均匀),稍稍离心一下,然后分装至9个PCR管中,每管48ul,再依次加入模板2ul,混匀,稍稍离心,上机
3》、保证把微量的反应物加进去
1)枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多),若看见有一个小水滴掉进去,证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加,可能加进空气。所有的试剂都加完后,要用枪混匀,然后用手动离心机离一下,使之没有气泡,不要用手剧烈震荡tube
2)枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心),否则使某些物质的量减少,所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法,也就是加样时沿着管壁螺旋式上升,等全部加完后离心混匀,如果有气泡,用手指轻轻弹几下,气泡就没了(有时ep管内有气泡,反正p时要加温,发现最后结果相差不大),而且确保液体都在管底。
3)在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时,加在管壁,而不是管底,在管壁形成一个小液滴,每个小液滴都孤立存在,用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!
4》、避免漏加或重复加
1)事先列出清单,准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。
2)少量加样时,可以把试剂分别先加到EP管壁,这样不仅可以确定是否加上了试剂,还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确;
3)加样时,将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧,加完的转移到另一侧。
4)将PCR试剂放在最右边的竖排,再将EP管从左边开始横排放,在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排,这样就可以清楚的区分哪些管加了
5)还有如没有太大影响的话,将加完的合上盖子,没加的盖子打开。
6)泡沫(软的那种)制作了个板子,把ep管放上去,在加样时用枪尖压下
5》、准确浓度:
1)试剂完全化后再加样,浓度准确。像镁离子,融化后最后用枪头再吹打完全混匀。
2)各种酶,用之前瞬时离心一下,如果买的大包装的,最好分装一下,以避免反复冻融。
3)试剂用之前瞬时离心一下.
6》、注意枪头和枪是否结合紧密,否则误差将会很大;
7》、枪头:枪头要买好的,不然你有好枪也没用。
在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
目前各家仪器公司推出自己的数字PCR,目前市场主流的是三家,1、LIFETechnologies3D数字PCR(芯片式数字PCR):我个人认为是微孔数字PCR,主要是将20ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应,变成20000个反应体系,PCR反应结束后,采用CCD拍照,数阳性反应孔。2、Bio-Rad的微滴数字PCR(油包水原理):将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系,PCR反应结束后,才有流式细胞术的原理,检测每一个液体,数阳性反应的液滴数量。3、RainDance的数字PCR(油包水原理)、原理与伯乐微滴数字PCR相同,但是其液体形成能力比伯乐强很多,理论上可以产生1000万个小油滴。价格从高到底:Raindance、Bio-Rad、LIFETechnologies。目前本人使用的是Bio-RadQX200、正在做实验室,希望广数字PCR的使用者可以相互交流,相互解答疑问,更好的利用数字PCR。
1、多种染料及淬灭基团自由选择。
2、专利的ZENTM或TAOTM双重淬灭
基团探针设计:
·更低的背景荧光
·增强endpoint信号强度
·较少交叉污染
多种荧光及淬灭剂用于多种实验需求
PrimeTimeqPCR探针灵敏度高,可靠性大,可用于多重或数字PCR。
淬灭基团染料有多种选择(如下图),与常见的qPCR平台兼容。
为您提供严格质控的高质量探针
所有的PrimeTime探针均通过质谱和HPLC纯化验证,不同批次间产物高度一致,为您减少后顾之忧。
双淬灭基团探针提高检测灵敏度
使用ZEN或者TAODouble-Quenched探针减少背景干扰,提高检测灵敏度。独有的内部淬火剂总是位于5’端荧光基团后9个碱基与3’端IowaBlack®淬灭剂一起作用最大化探针性能(如下图)。
与传统方法相比,可以将背景噪音降低4倍(如下图A)和信号值提高大约30%(如下图B),ZENDouble-Quenched探针给出更优的表现。
对于长探针同样高效适用
对于40碱基的长探针也可以有效淬灭,这意味着在探针设计上有更多选择,比如富含AT的区域。
希望对有需要的朋友有帮助,IDT探针合成,2073904839qq.com,www.nanodigmbio.com,
请教有没有人知道哪里可以做数字PCR(dd-PCR)的公司,急求!
跪谢!
数字PCR技术不断发展,Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。
QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月,Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术,相继推出了QX100、QX200微滴式数字PCR系统。
与其他数字PCR技术不同,Bio-Rad对样品进行微滴化处理。据该公司基因表达部门的销售经理Richard Kurtz介绍,他们的独特优势是能够产生非常均一、重复的1纳升液滴。这样的好处是每个样品形成20,000个液滴,而其他系统只能分成760-3,000个部分。分得越多,则意味着分析越准确。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。向左转|向右转