核酸扩增技术有别于传统的真菌诊断方法,即便是极微量的真菌DNA,也能够检测出。它具有灵敏度高,能够快速筛查出怀疑侵袭性真菌感染患者的优点。
然而,PCR扩增技术的致命缺点也源于它的高敏感性,有时极低水平的污染也有可能导致假阳性结果。尤其是某些宽泛的检查真菌感染方法,例如基于16SrRNA基因检测时,如果PCR试剂如TaqDNA聚合酶或是尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)被真菌污染,那么检测效果将大打折扣。
有文献报道称,空气中的分生孢子、PCR扩增所用的引物、探针、酶以及DNA提取试剂盒中微量的真菌DNA是污染的主要来源。
为了解决这个问题,来自奥地利儿童癌症研究所的Lion团队建立了一种基于双链特异性DNA酶去除真菌污染的方法。由于酶的双链特异性,单链DNA分子如引物、Taqman探针都不会被酶所消化,除非它们自身形成了发夹结构或引物二聚体。该研究结果发表在近期的Journalofclinicalmicrobiology杂志上。
1.在进行正式的诊断性实验前,先用双链DNA酶预处理PCR反应中的各种试剂。
2.每一种探针和引物配制成一定浓度的溶液后,先在40℃预热5分钟,以便去除探针自身形成的发夹结构或引物二聚体。
3.然后40℃30分钟,进行酶消化反应,之后再65℃15分钟灭活DNA酶。
4.MasterMix溶液酶消化的反应条件稍有不同,先37℃20分钟进行消化,之后60℃20分钟将酶灭活。
研究人员发现,不论是引物、探针还是MasterMix溶液,均存在一定程度的真菌DNA污染,经酶处理过的试剂,诊断性实验中PCR反应的Ct值明显高于未处理组,DNA产物浓度低于未处理组数百倍。通过使用这种双链特异性的DNA酶,大大降低了由试剂污染带来的假阳性结果的机率。
鉴于目前还没有商品化的真菌级别的试剂盒,研究人员强烈建议用这种方法常规监测PCR检测试剂是否存在真菌污染,预处理试剂消除可能存在的真菌DNA,对减少因试剂污染导致的真菌感染假阳性结果至关重要。
如果有商品化的试剂盒存在,可以将DNA酶直接加入到PCR反应中,缩短检测时间,那将是皆大欢喜的结果。一方面,简化了操作流程,减少了检测人员的操作步骤,可以更快出结果。另一方面也减少了患者和医生的等待时间。