![Signalchem/TGFB1 siRNA Set I/50 nmol/T831-911-50](images/Signalchem/smallvial.jpg)
Overview:
TGFB1 or transforming growth factor, beta 1 is a member of the transforming growth factor beta (TGFB) family of cytokines, which are multifunctional peptides that regulate proliferation, differentiation, adhesion, migration, and other functions in many cell types. High levels of TGFB1 protein have been localized in developing cartilage, endochondral and membrane bone, and skin and play a key role in the growth and differentiation of these tissues (1). TGFB1 can upregulate gene expression of its own converting enzyme furin in tumor cells, and mutations in TGFB1 gene result in Camurati-Engelmann disease (2).
Gene Aliases:
CED
Genbank Number:
BC022242
References:
1. Dickinson, M. E.et.al: Chromosomal localization of seven members of the murine TGF-beta superfamily suggests close linkage to several morphogenetic mutant loci. Genomics 6: 505-520, 1990. 2. Blanchette, F. et.al: TGF-beta-1 regulates gene expression of its own converting enzyme furin. J. Clin. Invest. 99: 1974-1983, 1997.
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1、测浓度和纯度,是否达标
2、跑电泳看条带是否与测的数据相互印证
如果上述两点满足,就不需要纯化,否则需要进一步纯化。
不过根据经验,一般都不需要,我们实验室用的是GNT系列的试剂盒,提取结果就直接进入下游实验了,效果挺稳定
质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体)中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子.现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌)、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子.
小鼠没有叶绿体,你可以直接参照小鼠线粒体的提取方法进行提取.
植物材料 用最精确的方法,称取不超过100mg的植物材料,置于处理过的研钵,加入液氮进行研磨 将研磨得到的粉末,快速转移至无RNase,并经过液氮冷却的2mL离心管(自备),
向左转|向右转
你可以用你的目的引物,用反转录第一链进行扩增,看看能不能得到目的片段.
人教版高中生物必修二有这个图
RNA制备过程中究竟有哪些问题需要注意,又有哪些工具可以助我们一臂之力呢,且听下文分解。
RNA制备的四大祸害碱性条件、金属离子和高温都会促使RNA分子水解。因此,RNA操作一般在0°C-4°C的中性或微酸性缓冲液中进行,人们也常常在其中添加螯合剂,比如0.1mMEDTA。有些应用不允许EDTA的存在,这时可以通过离子交换树脂来去除阳离子。
在制备RNA时,RNase一直是个令人头疼的大问题,因为这种酶基本上无处不在。生物样品本来就含有RNase,它们存在于细胞的小隔间里,当细胞被裂解时这些RNase就释放出来。另外,实验室操作也很容易引入RNase。“这种酶到处都是,我们皮肤细胞上就有。如果你戴着手套接触了脸或者手臂,也会沾到一些RNase,”Promega公司的产品经理EricVincent提醒道。
在收获组织或细胞时,“提取RNA要越快越好,或者就想办法令RNase失活,”NEB公司的RNA研究带头人BretRobb指出。
如果不能立刻提取RNA,就应当通过速冻来稳定样本,或者将样本储存在特殊的RNA保存液中,比如AllProtectTissueReagent、RNAlater。此外,PreAnalytiX公司的PAXgeneBloodRNATube也很适合保存这样的样本,“不仅能确保RNA的安全,而且让细胞不会因为温度或缓冲液条件的改变表达任何转录本,”Qiagen公司的MartinSchlumpberger介绍道。PreAnalytiX是BD和QIAGEN的一个合资公司。
绝大多数RNA分离试剂盒中的裂解缓冲液(例如Qiagen公司的RNAEasy),“可以失活任何样本所带的RNAse,”Schlumpberger解释道。“这些产品对于RNA来说是相当安全的。”如果你更喜欢自己DIY,那么异硫氰酸胍、酚/氯仿和SDS都能帮你保护样本中的RNA。
据介绍,RNA纯化之后对环境中的RNAse最为敏感,这个时候需要特别注意预防RNAse的污染。
可不可以做到万无一失如何才能保证RNA实验的成功,这已经是一个老生常谈的问题了。RNA操作时应该戴上一次性手套,并且在专门的空间里进行,尤其要与质粒制备和细菌操作分开。操作者尽量不要接触洁净度不能令人百分百放心的物品。
我们来看看NEB公司是如何做到万无一失的。NEB公司的RNA实验室统一使用RNA专用的一次性耗材。他们认为高压灭菌会使溶液中的微生物释放出RNase,而这些RNase会在灭菌之后复性。因此NEB公司只信任经过认证的无RNAse器皿,抛弃了高压灭菌过程。Robb介绍道,目前市面上有许多经过认证的RNA专用产品(试剂盒、试剂和耗材),进行RNA实验已经比十几年前容易得多了。
“过去人们在配制溶液的时候总是胆战心惊,恨不得屏住呼吸进行称量和搅拌,以免把RNase带到样本中去,”他解释道。而现在,你可以很方面的买到各种无RNAse的试剂,从水、1MTris到5MNaCl。“使用这些试剂可以为RNA实验提供额外的保障。”
许多无核酶的塑料产品都经过了第三方的检测和认证,MoBioLaboratories就提供这样的服务。“我们可以帮助制造商建立始终如一的无污染生产线,”培训操作者如何识别和消除污染源,MoBio公司的CarlTsang介绍道。
我国大多数实验室还是使用玻璃器皿,这些器皿至少需要在180°C的条件下烘烤几个小时,才能确保将RNAse永久性地摧毁。之后,研究者们可以通过商业化的试剂盒进行RNAse检测,比如NEB公司的RNAse污染分析试剂盒。
添加剂的使用DEPC(Diethylpyrocarbonate)一直被用于处理水和溶液,失活其中的RNAse。“多余的DEPC可以在高压锅中去除,因为DEPC在高温下很不稳定,会释放出CO2然后消失,”Schlumpberger说。不过许多人并不爱和这种可能致癌的化合物打交道,Schlumpberger强调,如果没有正确处理,残余的DEPC也会使RNA失活。
对于那些不能高压灭菌的器物,我们可以用RNaseAway试剂处理,然而将其浸泡在无RNAse的水里。
Vincent指出,RNAse抑制剂的使用应当成为常规。以Promega公司的RNAsin为例,RNAse抑制剂能够特异性结合并抑制实验室中常见的RNAse,包括RNAseA、B、C和人胎盘RNAse。“等你发现引入了RNAse时往往已经太迟了,多加一层保险是很有必要的,”他说。
只要我们了解威胁RNA的主要因素(高pH、高温、金属离子和内切酶),就能够想办法一一化解。这时你会发现,RNA制备其实并没有那么难。
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