| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 杂交溶液A中杂交过的小鼠胚或鸡的胚胎或器官样本 试剂、试剂盒 | 预杂交溶液A70℃2×SSCpH4.570℃0.1%(VV)CHAPS3-[(3-胆胺丙基）二甲铵]-I-丙烷磺酸盐）(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)2×SSC70℃ 仪器、耗材 | 塑料的巴斯德吸管可放置2ml微量离心管的70℃加热块旋转平台37℃和70℃水浴锅20ml的咬合盖玻璃小瓶锡箔带照相机的解剖显微镜 实验步骤 | 1)从杂交过的小鼠胚或鸡胚或器官样本移除杂交溶液并加入800μL预杂交溶液A，7℃洗5min。 2)不要移除预杂交溶液，向试管中再加入400μL2×SSC,pH4.5溶液，70℃洗5min,重复加2×SSC2次，并再洗2次。 3)移去混合液，并在0.1%CHAPS/2×SSC中70℃洗两次，每次洗30min。 4)用含有20μg/mlRNA酶A的0.1%(V/V)CHAPS/2×SSC溶液37℃消化1h。 5)先用MAB室温下洗样本两次，每次10min,再在70℃用MAB洗2次，每次30min。 6)PBS室温下洗样本两次，每次10min。 7)PBT室温下洗5min。 8)室温下用封闭液封闭样本2〜3h。 9)移去封闭液，加入2ml预吸附处理的连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体Fab片段。4℃下轻摇过夜。 10)移除溶液并加入0.1%(m/V)BSA/PBT溶液，将样本转移到20ml的带咬合盖玻璃小瓶中，用0.1%(m/V)BSA/PBT溶液室温下洗5次，每次45min并轻轻摇晃。 11)用PBT溶液洗2次，每次30min。 如果使用BoehringerMannheim公司的BM紫AP底物溶液则只需洗2次。 13)将样本完全浸没于3mlNBT/BCIP显色溶液或者BM紫AP底物溶液中孵育。用锡箔包住小瓶轻轻摇晃20min开始显色。 14)用肉眼或者用解剖镜观察染色情况。当信号达到希望的水平时（20min〜48h),用PBT至少洗6次以停止显色反应。 显色的样本能够在4℃下含有100mmol/LEDTA的PBT中保存2〜3个月而不影响信号强度。 15)可选：在4%PFA/PBT中4℃固定样本过夜。用PBT洗样本数次然后在PBT中4℃存储。 16)样本放在PBT溶液中在皮氏培养皿拍照。 注意事项 | 其他 | 其他试剂： 20μg/mlRNaseA(BoehringerMannheim)溶于0.1%CHAPS/2×SSC,70℃。 马来酸缓冲液（MAB)70℃和室温，PBS，PBT：0.1%Tween-20/PBS，封闭液 连接碱性碟酸酶的抗地高辛抗体的Fab片段（BoehringerMannheim),预吸附的40℃，0.1%(m/V)BSA/PBT，碱性磷酸酶缓冲液pH9.5(NTMT),新鲜配制 2mmol/L左旋咪唑/NTMT(可选的），NBT/BCIP底物溶液或者BM紫AP底物 |
