一、制备含DNA纤维的载玻片标本

大多数类型的细胞，只要保持没有固定或干燥且细胞核完整，都适于做纤维FISH分析。冻存组织标本和沉淀的细胞团块，只要组织能重新悬起成细胞悬液，就还可以使用。有大量细胞质的细胞需要更剧烈的处理以使其裂解。一般情况下都是先采用最温和的方法，如果裂解不充分，就增加SDS的处理。

制备开始前，将下列物品放置在冰上：

1.每种晕圈溶液和超纯水配制的0.05%SDS溶液分别放入IOOmL烧杯中，另外两个IOOmL烧杯分别装超纯水。

2.一个试管装20%BSA，另一个试管装PBS。

3.玻璃板（5mm厚）。

制备细胞悬液

适用于培养的细胞，外周血细胞或者其他细胞悬液：

1.将ImL细胞悬液或胰酶消化的细胞（10000?100000个细胞）装在Eppendor僧中，用微量离心机离心数秒钟。

2.弃上清。

3.将细胞重悬于20(^LPBS中（4°C)。

适用于冰冻组织：

1.切一片或几片45；xm厚度的冰冻组织片（见注释3)。

2.装在Eppendorf管中，置于干冰上。

3.使用前一直放置在干冰上。

4.融化组织30s左右。

5.加入大约50(VLPBS(4°C)。

6.剧烈上下抽吸碎组织片至形成悬液。

制备DNA纤维载玻片

1.取20pL细胞于离心管中，加PBS(4°C)至47.5pL，加入2.5^20%BSA/PBS溶液，混合均匀。

2.取上述悬液滴到标本上，用吸头将液体均匀的铺在整张载玻片上。

3.将载玻片放置在冰冷的玻璃板上2min。

4.将载玻片（磨砂边朝上）垂直立在纸上沥去多余的液体。

5.用压缩空气缓慢风干直到片子边缘干燥（外周血细胞和培养细胞等容易裂解的细胞，可省略步骤6?9)(见注释4)。

6.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液1中30s。

7.大约用3s时间从溶液中缓慢取出片子，然后用7s的时间用纸吸干多余的液体（见步骤4)。

8.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液2中30s。

9.大约用3s时间缓慢取出片子，然后用7s的时间用纸吸干多余的液体（见步骤4)。

10.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液3中45s。

11.大约用3s时间缓慢取出片子，然后用7s的时间用纸吸干多余的液体(见步骤4)。

12.用纸擦净片子背面。

13.将片子水平放置在在冰冷的玻璃板上。

14.将湿片子放置在UV灯下，保持1?IOcm的距离（见注释5)。

15.立即用254nm波长照射1?IOmin(见注释6)。

16.将片子垂直放置在纸上IOs(见步骤4)。

17.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液4中30s。

18.大约用3s时间缓慢取出片子，然后用7s的时间用纸吸干多余的液体(见步骤4)。

19.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液5中30s。

20.用大约3s时间缓慢取出片子，然后用7s的时间用纸吸干多余的液体(见步骤4)。

21.用超纯水洗2次。

22.垂直将片子立在架子上使其干燥，室温放置数分钟。

23.用荧光显微镜16倍物镜和TRITC滤光片（见注释6)观察片子以及检查是否（a)细胞适度裂解（图1C)(见注释7);(b)细胞的数目足够（图1D)(见注释8);(c)彗星状结构的（即纤维）数目足够（图1E)(见注释8)。

24.杂交前放置在室温过夜干燥；要放在密闭的容器中一20°C可长期保存。

二、探针标记

1.在离心管中配制以下混合物：5juL10X切口缓冲液、5^L0.1m〇l/LDTT、知L核酸混合物、0.5^L已标记的核苷酸、ljugDNA，用超纯水调整体积至44，。

2.将混合物放置在冰上，加I1ULDNA聚合酶。

3.用冰冷的超纯水按1:500/1:1000/1:2000梯度稀释DNaseI储存液。

4.加入5pL稀释的DNaseI。

5.16°C孵育2h。

6.将反应体系放在冰上，取5pL用2%琼脂糖凝胶检测片段大小（见注释9)。

7.加入20.jugssDNA和20jLig酵母RNA。

8.加入0?1倍体积的3mol/LNaAc和2.5倍体积的一20°C无水乙醇沉淀DNA。

9.冰水混合物上放置30min。

10.用微量离心机以最大转速离心30min，去掉乙醇并空气干燥沉淀物。

11.用杂交混合液重悬探针，浓度为30?60ng/jaL，37°C溶解30min，避光储存（4°C或一20°C)。

三、杂交

1.将含有纤维的载玻片在80°C玻片电热板上烤2h(见注释10)。

2.制备探针混合物：每种标记的黏粒/PAC/P1探针3ng/VL和每种探针加50倍过量的Cot-1DNA并加杂交混合液至KVL。

3.探针混合物在80°C变性8min。

4.冰上放置2min退火。

5.混匀，以微量离心机稍离心。

6.37°C水浴预复性探针30min。

7.将12(^L变性混合液（70%去离子甲酰胺/2XSSC/50mmol/L硫酸葡聚糖）加到24mmX60mm盖片上。

8.将载玻片有纤维一面覆盖到盖片上，使变性混合液自然展开。

9.翻转载玻片，使盖片一面朝上，将载玻片放在80°C电热板上精确地加热3min。

10.轻轻彳顷斜载玻片，使盖片自然滑脱。

11.冰上用2XSSC(4°C)洗2min。

12.用70%乙醇（一20°C)洗5min。

13.室温下依次用90%、100%乙醇脱水。

14.将标本垂直放置在架子上，气干。

15.将IO^L探针混合物加到载玻片上。

16.盖上24mmX24mm盖片。

17.正面朝下于37°C湿盒中杂交过夜。

四、杂交后洗脱和免疫检测

于37°C水浴中预热400mL2XSSC:

1.在盛有37°C2XSSC染色缸中浸泡5min，使盖片自然滑落（见注释11)。

2.37°C下2XSSC中洗3次，每次5min。

3.TNT溶液中洗5min。

4.将120^LTNB溶液加到24mmX60mm盖片上，将片子有纤维的一面覆盖到盖片上。

5.正面朝下于37°C湿盒中孵育20min。

6.制备I:1000鼠抗地高辛抗体和以TNB溶液稀释的I:100德克萨斯红标记的链霉亲和素，每张载玻片12〇iuL。

7.在TNT溶液中洗脱盖片。

8.将抗体混合物加到24mmX60mm盖片上，反转载玻片覆盖到盖片上。

9.正面朝下于37°C湿盒中孵育20min。

10.在TNT溶液中洗脱盖片。

11.TNT溶液洗3次，每次5min。

12.以TNB溶液配制1:1000FITC标记的兔抗鼠抗体和1:100生物素化山羊抗链霉亲和素抗体，每张载玻片12〇^L。

13.将抗体混合物加到24mmX60mm盖片上，反转载玻片覆盖到盖片上。

14.正面朝下于37°C湿盒中孵育30min。

15.以TNB溶液配制1:100FITC标记的山羊抗兔抗体和1:200德克萨斯红标记的链霉亲和素，每张载玻片120/iL。

16.在TNT溶液中洗脱盖片。

17.TNT溶液中洗3次，每次5min。

18.将抗体混合物加到24mmX60mm盖片上，反转载玻片覆盖到盖片上。

19.正面朝下于37°C湿盒中孵育30min。

20.在TNT溶液中洗脱盖片。

21.TNT溶液中洗3次，每次5min。

22.依次用70%、90%、100%乙醇系列脱水。

23.空气干燥。

24.加IO1^L抗淬灭剂到载玻片上，盖上24mmX60mm盖片。

五、信号观察与结果判读

载玻片上的背景非常高是由于探针的片段太长，然而，这种背景是很容易与线性排列的串珠状纤维区分开（图1E)。根据Vaandrager等的方法对FISH信号进行分析[11]。已知的探针间距离和（或）探针长度（如通过限制酶酶切作图或脉冲场凝胶电泳所获得的）提供了内部的长度参照[14]。不同载玻片上DNA凝集程度的不同可以使用数字化图像的计算机辅助延伸和压缩加以消除，以达到正常条形码的全长。当出现诸如断裂导致的异常条形码时，来自于正常等位基因的正常条形码信号的存在可证实其杂交效率。定位断裂点所必需的全部纤维的数量依赖于最初细胞悬液中肿瘤细胞的数量。然而，通常通过测量5个正常与异常的条形码残基就可以准确定位断裂点[14]

注释

1.尽管许多载玻片的表面处理都适合进行纤维FISH，但就我们的经验来看，特殊的涂层处理是不必要的。

2.建议采用柱子纯化探针DNA用于缺口平移，因为DNaseI对很少量的苯酚、盐和RNA的污染非常敏感。

3.可以将标本切成几片并于一70°C保存至两个月。每次实验需要的切片数量依赖于裂解细胞所使用的条件，剧烈的裂解可从载玻片上脱落更多的细胞。

4.使载玻片保持水平会有彩虹样水印产生。

5.UV照射使DNA产生缺口。照射过量会产生小的DNA片段，这些片段会从片子上脱落；而照射剂量太小，将导致仅有很少信号的无效杂交。因此，每次在实验前经常确定适当的照射剂量事实非常重要的，采用从1?IOmin变换照射时间长度以及从1?IOcm变换UV灯与载玻片之间的距离。也可以使用Strata-Iinker装置。切记在UV照射的全程需要对眼睛和皮肤采取适当的保护措施。

6.不要盖盖玻片，也不要使用油。

7.应该出现彗星状的结构（图1E)。若细胞核仍呈亮红色球状，则表明裂解不充分（图1C)。这种情况下需进行以下步骤：将载玻片慢慢垂直浸泡在0.05%SDS中10?30s，沥尽过量液体，将载玻片在晕圈溶液1中浸泡IOs后继续步骤10。但是SDS常常造成固定在载玻片上的细胞脱少，这种情况下，也应该用更多的细胞或者使载玻片更干燥。载玻片越干燥，裂解就越困难，所以应注意标本不要太过干燥。

8.当整张载玻片都出现彗星状的结构以及排列整齐时，表明纤维数量是足够的（图1E)。如果载玻片呈云雾状，而且可见亮的晶体状物质，就表示细胞数量太高了，应该减少细胞的数量（图1D)。如果整张载玻片完全是黑的（除了杂质），那么就应该在步骤3后检查细胞悬液，确认有细胞存在。如果在悬液中很容易观察到细胞，那就有可能裂解步骤时细胞脱落了，则应跳过步骤5,直接在步骤6中吹干载玻片，如可以完全吹干上半部，保留潮湿的下半部，然后用晕圈溶液3处理。如果采用上述步骤后细胞还是裂解不充分，那只有重新离心细胞悬液，弃上清后用50?IOOjULFCS重悬细胞并于一70°C冻存过夜，然后快速融化并从步骤3.I.1开始重做实验。

9.探针用生物素和（或）者地高辛标记，理想的探针片段大小为400~800bp。探针片段的大小可以采用标准的缺口平移程序通过调整DNaseI的用量加以控制。可用2%琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，并以生殖细胞纤维进行检测。标记后，沉淀探针并溶于杂交混合液中，可以同时混合多个探针而不改变杂交条件。

10.室温下干燥过夜或者经一20°C保存的载玻片都可以使用。

11.任何时候都不要使用外力剥离盖玻片，应该在染色缸中浸泡自然脱离。