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清蛋白分子量小，电泳移动的最快，所以在最前面。

根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?

用镍柱镍柱分离纯化
固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子。位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子，例如锌。铜，镍，铁等形成复合物。因此，该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的蛋白质。但是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和。但是亲和力比组氨酸要弱。所以，结合的强度是和缓冲液的PH和金属离子决定的。
金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料，借助醚长生7个原子的空间。
全部容量：24-30um的含有zn的干胶
柱料结构：6%的高铰链的琼脂糖
柱料大小：45-165um
平均微粒：90um
直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小时可达700厘米
最大压强：0.3MPa
PH变化：长期3-13
短期2-14
化学稳定：通用含水缓冲液
0.01M盐酸，1.0M NAOH,20%乙醇（保存7天）
物理性质：可以忽略在PH或者离子变化下的体积变化
耐热性能：121度下0.1M乙酸钠作用半小时
金属螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要搅拌驱除20%乙醇溶液。换成去离子水。比例是25%去离子水和75%处理胶。
处理金属螯和柱料：
1 平衡所有用到的材料于室温。
2 搅拌金属螯和柱料
3 倒水进柱子，驱除气体。用无离子水液封几厘米。
4 将金属螯和柱料连续倒进柱子，用玻璃棒支撑柱壁防止气泡形成。
5 然后立即用无离子水液封，装上柱盖，连接上泵。
6 打开柱子底部的开关，然后调节泵的流速。通常是不超过0.3MPa的。
7 经过一个稳定的柱床填鸭后，维持填压速度为3个柱床。
使用adaptor
1 经过上溯填鸭后，关闭柱床下面开关，移开上面的薄膜，小心的加上去离子水进行液封。
2 一定角度插入adaptor，确保没有气泡。
3 确保所有的连接都没有问题，柱子/泵/样品接受器
4 倾斜插入活塞确保没有气泡和管道充满液体。利用活泵正反向的流动确保没有气泡。
5 固定adaptor，打开柱子开关，开始缓冲液的流动。先以填鸭的速度直到柱床稳定后。

固定金属离子：
金属螯和柱料通过水来螯和金属的，避免发生沉淀在胶上。
1 确保柱子已经平衡好。如果有必要可以洗2个柱床（去离子水）
2 选择金属离子和0.1-0.3M中弱性酸。例如铁离子PH 3左右就好，避免形成沉淀和共沉。
3 加入一倍柱床的金属离子溶液
45倍柱床的去离子水洗涤
5至少2倍柱床的平衡缓冲液
结合：
发生于PH5.5-8.5之间.最强反映发生于最后
初始缓冲液的选择决定于金属离子和样品的结合性质。乙酸钠或者磷酸钠是比较好的缓冲液中不能使用EDTA或者柠檬酸盐
最通用缓冲液：
0.01-0.2M磷酸钠
0.05M乙酸钠
强烈推荐加入0.15-0.5M NaCl用于防止离子交换。
通常如果不知道一个蛋白的结合能力，最好的就是使用锌离子和中性的磷酸或者乙酸盐，同时含有0.15-0.5M NaCl
去垢剂不会影响蛋白质的结合能力
金属离子的取代意味着蛋白发生了结合。这种现象可以通过颜色来决定
洗脱蛋白：（3种方法）
1 降低PH(一步或者分步)，大部分蛋白溶解于PH4-6最终3-4是可容的。可选择柠檬酸盐，磷酸或者乙酸盐。
2 逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M），梯度变化最好是在初始缓冲液的PH范围。
3 加入EDTA或者EGTA可洗脱蛋白质。但是不是通用的。
利用离心或者重力作用纯化组氨酸位点蛋白
通过上镍进行选择性结合含有组氨酸位点蛋白，然后利用含有咪唑的缓冲液洗脱蛋白。

以下的实验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料，然后确保能够洗脱下来。当结合和洗脱的条件尚未明了时，这些方法也是很好用的。
为了获得高纯度的蛋白，必须摸索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度。通常使用10mM-500mM范围的咪唑的缓冲液进行剃度洗脱，然后通过收集和SDS-PAGE 蛋白电泳确定洗脱浓度。
为了纯化不可容的含有his位点的蛋白质，（包含体），可以在变性条件下进行。利用8M尿素或者6M盐酸呱进行溶解蛋白。
样品处理：
样品要经可能溶解，避免出现堵塞现象，所以可以利用0.45uM虑膜过滤杂志
如果样品时溶解于20mM磷酸缓冲液中（含有0.5M Nacl,PH7.4），必须调整PH到7－8。
上柱前准备：
洗柱料：
1 亲柔震动胶瓶充旋胶料
2 利用吸管吸出足量柱料用以纯化目的。每毫升柱料可以吸纳5毫克蛋白
3 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
4 小心去除上清
5 加入5倍体积去离子水，充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟，不要机械搅拌。
6 再次500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
7 再次小心去除上清
挂镍：
1 加入0.5倍柱床体积0.1M硫酸镍，充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟，不要机械搅拌。
2500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3小心去除上清
洗柱：
1加入5倍体积去离子水，充分振荡柱料，来回倒置5分钟
2500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3小心去除上清
4 再洗两次柱料（一共3×5柱床去离子水）
5 最后用一倍体积起始缓冲液充旋柱料（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）

利用离心来纯化：
上样：
1 在起始缓冲液中加入样品，然后使整体胶浓度达到50％
2 亲柔搅拌，室温离心5－30分钟，结合能力取决于蛋白和样品浓度。
3 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
4 取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳
洗胶：
1 加入5倍体积起始缓冲液，搅拌5分钟
2 500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳
4再洗两次柱料（一共3×5柱床起始缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白
电泳
洗柱：
1 加入2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）搅拌5分钟
2再次500g 离心2－5分钟，沉淀柱料。
3再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脱缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN
利用流速和重力纯化：
1 在柱子底部加上滤器
2 加水排气
3 加柱帽，去除残余水。推荐是最多2 Ml柱料就可以了
样品结合：
1 倒胶进入柱子
2 小心上样，用波棒室温搅拌5－30分钟
3 打开柱帽，收集流出峰用于分析
洗胶：
1 加入5倍体积起始缓冲液，收集流出液用于SDS-PAGE 蛋白电泳
2再洗两次柱料（一共3×5柱床起始缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白
电泳
洗柱：
1 加上柱帽，加入2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）搅拌5分钟。打开柱帽，收集流出峰
2再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脱缓冲液）。记得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN
注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5
常见问题：
1 样品太粘稠
答：核酸存在影响，可以继续超声，加入RNA酶至10ug/mlDNA酶至5ug/ml。然后冰浴1
0－15分钟。或者也可以用注射器来回充旋。这样可以防止堵塞柱料。
2 平衡时样品洗脱了下来
答: 检查PH和缓冲液成分，如果缓冲液成分不正确，EDTA加入，强还原剂加入，都会导致这个现象出现。
加大胶的量，如果胶料承载能力过头，也绘出出现这现象。
准备新鲜的柱料，如果柱料断裂，也挂不上蛋白。
3 在洗脱液中不含有组氨酸蛋白
答：如果SDS-PAGE 蛋白电泳已经发现蛋白存在于超声液中
超声可能不完全。可以用显微镜观察超声情况。AD260/280比值。（通常是超声前将10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL，PH6-8），避免发泡以降解融合蛋白。
蛋白可能是是包含体，可以使用4－6M盐酸呱或者4－8 M尿素溶解。
尿素溶解的可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳，盐酸呱溶解的不可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳，必须换缓冲液。
洗脱液浓度太稀，可以加大咪唑浓度或者降低PH 来决定最佳洗脱条件如果在平衡前的洗柱发现了目的蛋白，证明起始缓冲液中的咪唑浓度太高，可适当降低。
4 考马氏亮蓝或者银染发现多条带
答：加入蛋白激酶抑制剂。可能是蛋白降解。用凝血酶切割前必须去除丝氨酸蛋白酶抑制剂采用梯度咪唑来洗脱蛋白。在平衡洗脱液中加入10mM咪唑可以洗脱大量杂质而不会洗脱融合蛋白。低于500mM咪唑可以洗掉绝大部分杂质。
在洗脱步奏往起始缓冲液加入去垢剂（2％TRITON x-100或者2％Tween20）50% 葡萄糖，20mM B-巯基乙醇。记得杂质通常没有特意结合能力，可以改变缓冲液来洗脱。
如果杂志和目的蛋白有相同结合能力，那就不能用于纯化。因此可以使用别的纯化系统，例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽琼脂糖4B
柱料再生，清洁和保存
柱料再生：
1 使用0.05M EDTA,0.5M NaCl来洗脱镍离子。然后用3柱床的0.5M NaCl来洗干净EDTA
2如果是铁离子可以用0.05M EDTA泡过夜
3 这一步可以洗脱上面未能洗脱的残余结合蛋白
清洗柱料：
1 0.5倍柱床2M NaCl，反向洗脱10－15分钟
2 1M NaOH洗1小时去除残余蛋白
3 每一步都要用3倍柱床起始缓冲液清洗
4 4倍柱床70%乙醇洗脱强亲水蛋白和脂类蛋白。
也可以使用2倍柱床去垢剂。0.1-0.5%非离子去垢剂溶于0.1M乙酸。浸泡1－2小时。最后用5个柱床的70％乙醇去除去垢剂。
清洁：
1 尽可能去除微生物
2 0.5-1M NaOH反向流动半小时
3 再用3－5倍柱床消毒的起始缓冲液平衡
4 这个清洁步奏不一定能够提高纯化能力
保存：
长期保存于20％乙醇或者0.01M NaOH 于4度

求大神赐教，急急急！！！！在这里先谢过大家。。。

人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67kDa。成熟的人血清白蛋白是一个心形分子，由3个结构相似的α-螺旋结构域组成。向左转|向右转

我想做关于血清铁蛋白的电泳，首先要分离和纯化铁蛋白。请各位老师和学长指点。

his-tag的蛋白，40多kD，提的包涵体，溶解后有不少杂带，大小条带都有，相对量倒是不大。现在兔子已经四免了，得到了抗血清。该如何纯化血清，得到较多的针对目的蛋白的抗体呢。
可以先用柱子提纯包涵体里的his-tag蛋白，然后再IP么？
谢谢

各位朋友，我最近在做一植物病毒的外壳蛋白的表达；
蛋白已经表达出来了，接下来要去做抗血清。
想要请公司做；
我看了论坛里很多帖子，做抗体的对蛋白的要求好像很低啊。
我想问我菌煮沸SDS-PAGE割胶回收的蛋白能不能用于抗血清的试验？（如果这样能用，可以省很多事情啊，不用去超声波，过柱子等纯化步骤）
量大概需要多少啊？

脂蛋白分离纯化

一、分离脂蛋白

血浆是分离纯化脂蛋白的首选标本。从血浆（血清）中可分离得到CM、VLDL、LDL和HDL，再经脱脂除去脂蛋白中的脂质，剩下的部分为载脂蛋白的混合物。这一操作过程是获得载脂蛋白的最佳方法。

二、脱脂

由于各种脂蛋白含脂的种类和质量不同，脱脂剂组成略有差异。目前常用的几种脱脂方法有如下几种。

1．Warnick等法

将纯化的脂蛋白慢慢加入到预冷（-20℃）的丙酮：无水乙醇（1：1，V/V）混合液中，脱脂液的量为样品的20倍，不断搅拌，然后在-20℃冰箱放置过夜，4℃离心沉淀，将沉淀重复脱脂一次，用氮气吹干或真空干燥，脱脂物0℃贮存待用。

2．Scanu等法

将脂蛋白加入到预冷的（-15℃）无水乙醇：无水乙醚（3：2）混合液中，不断搅拌，以12h过夜，在-10℃或4℃离心（2000r/min），去上清留沉淀，再重复脱脂一次。用N2或真空干燥，0℃贮存待用。

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,具有不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体.当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞.被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中.如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆.单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体. 简介 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上,创建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,成为杂交细胞系,既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性,又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点.将这种杂交瘤作单个细胞培养,可形成单细胞系,即单克隆.利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的,而且在培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能.这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的. 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位.因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景. 2制备过程 1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程. 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射. 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞. 2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液. 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇.在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞. 3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基.在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡. 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡. 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖. 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化.通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养.采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增.经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存. 5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法. (1)体内诱生法 取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理.1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞.杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克隆抗体.约1-2周,可见小鼠腹部膨大.用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体. (2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养.在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆抗体.但这种方法产生的抗体量有限.各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量.

问个小小白的问题：
样本是经过磁珠纯化过的血清蛋白，用MALDI-TOF-MS仪器得到质谱图。请教下：
1.每个峰都是一个纯的蛋白？
2.根据m/z能匹配蛋白的名称不？

我认为应该采取静脉注射的方法将该蛋白加入实验鼠中.以防止蛋白进入消化道中被消化.其他条件相同情况下再一个对照组,观察小鼠的变化.