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Strept. Avidin Horseradish Peroxidase, 1mg

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人造纤维的一个类别,指由从牛奶、大豆、花生、玉米等自然物中提取到的蛋白质为原料,溶解于适当溶剂中所制得的纤维。该纤维在20世纪30年代开始实现工业化生产,随着众多合成纤维的问世,相继停止生产。由于该纤维手感柔软,穿着舒适;进入90年代以来,又有生产者开始从牛奶中提取乳酪蛋白... 查看更多>
血清前白蛋白是主要存在于血液中的运输蛋白,因电泳时位于白蛋白(Alb)之前而得名。PA的主要生理功能是结合、运输维生素A和甲状腺素,从而参与它们的调节。此外,PA还具有胸腺活性,可通过促进淋巴细胞成熟来增强机体免疫力,并在抗肿瘤方面有潜在的作用。人血清PA含量与人体的生理、病理状... 查看更多>
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1。根据序列比对,相似性分析,初步估计蛋白质可能的功能2。查阅文献,看有否相关研究3。如果用血清,在未知功能情况下,很难有所作为,建议等初步知道功能后,用血清是验证抉具体作用的4。比较常用的未知基因分析方法,是从基因水平入手:将该基因敲除(现在可以考虑RNAi),看看在功能组、蛋白 查看更多>
牛血清蛋白(V)第五组分是个什么概念? 查看更多>
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1.什么是western blot?答:WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。2. western blot有什么优点?答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg级。方便,特异性高。3. western blot的具体步骤是什么?答:一.制样(以提动物组织总蛋白为例),1) 组织洗涤后加入3倍体积PBS,0℃研磨。2) 加入5×STOP buffer3)180W, 6mins,0℃超声波破碎4)5000rpm,5mins离心 查看更多>
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芯片生化反应概述.pdf123
晚安8642021-07-31
一般认为血清白蛋白的正常值为40-55g/L,血清球蛋白为20-30g/L,血清总蛋白的正常值为60-80g/L,白球比的正常值为1.5-2.5。向左转|向右转
用镍柱镍柱分离纯化
固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子。位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子,例如锌。铜,镍,铁等形成复合物。因此,该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的蛋白质。但是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和。但是亲和力比组氨酸要弱。所以,结合的强度是和缓冲液的PH和金属离子决定的。
金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料,借助醚长生7个原子的空间。
全部容量:24-30um的含有zn的干胶
柱料结构:6%的高铰链的琼脂糖
柱料大小:45-165um
平均微粒:90um
直流速度:25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小时可达700厘米
最大压强:0.3MPa
PH变化:长期3-13
短期2-14
化学稳定:通用含水缓冲液
0.01M盐酸,1.0M NAOH,20%乙醇(保存7天)
物理性质:可以忽略在PH或者离子变化下的体积变化
耐热性能:121度下0.1M乙酸钠作用半小时
金属螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要搅拌驱除20%乙醇溶液。换成去离子水。比例是25%去离子水和75%处理胶。
处理金属螯和柱料:
1 平衡所有用到的材料于室温。
2 搅拌金属螯和柱料
3 倒水进柱子,驱除气体。用无离子水液封几厘米。
4 将金属螯和柱料连续倒进柱子,用玻璃棒支撑柱壁防止气泡形成。
5 然后立即用无离子水液封,装上柱盖,连接上泵。
6 打开柱子底部的开关,然后调节泵的流速。通常是不超过0.3MPa的。
7 经过一个稳定的柱床填鸭后,维持填压速度为3个柱床。
使用adaptor
1 经过上溯填鸭后,关闭柱床下面开关,移开上面的薄膜,小心的加上去离子水进行液封。
2 一定角度插入adaptor,确保没有气泡。
3 确保所有的连接都没有问题,柱子/泵/样品接受器
4 倾斜插入活塞确保没有气泡和管道充满液体。利用活泵正反向的流动确保没有气泡。
5 固定adaptor,打开柱子开关,开始缓冲液的流动。先以填鸭的速度直到柱床稳定后。

固定金属离子:
金属螯和柱料通过水来螯和金属的,避免发生沉淀在胶上。
1 确保柱子已经平衡好。如果有必要可以洗2个柱床(去离子水)
2 选择金属离子和0.1-0.3M中弱性酸。例如铁离子PH 3左右就好,避免形成沉淀和共沉。
3 加入一倍柱床的金属离子溶液
45倍柱床的去离子水洗涤
5至少2倍柱床的平衡缓冲液
结合:
发生于PH5.5-8.5之间.最强反映发生于最后
初始缓冲液的选择决定于金属离子和样品的结合性质。乙酸钠或者磷酸钠是比较好的缓冲液中不能使用EDTA或者柠檬酸盐
最通用缓冲液:
0.01-0.2M磷酸钠
0.05M乙酸钠
强烈推荐加入0.15-0.5M NaCl用于防止离子交换。
通常如果不知道一个蛋白的结合能力,最好的就是使用锌离子和中性的磷酸或者乙酸盐,同时含有0.15-0.5M NaCl
去垢剂不会影响蛋白质的结合能力
金属离子的取代意味着蛋白发生了结合。这种现象可以通过颜色来决定
洗脱蛋白:(3种方法)
1 降低PH(一步或者分步),大部分蛋白溶解于PH4-6最终3-4是可容的。可选择柠檬酸盐,磷酸或者乙酸盐。
2 逐步提高咪唑的浓度(0-0.5M),梯度变化最好是在初始缓冲液的PH范围。
3 加入EDTA或者EGTA可洗脱蛋白质。但是不是通用的。
利用离心或者重力作用纯化组氨酸位点蛋白
通过上镍进行选择性结合含有组氨酸位点蛋白,然后利用含有咪唑的缓冲液洗脱蛋白。

以下的实验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料,然后确保能够洗脱下来。当结合和洗脱的条件尚未明了时,这些方法也是很好用的。
为了获得高纯度的蛋白,必须摸索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度。通常使用10mM-500mM范围的咪唑的缓冲液进行剃度洗脱,然后通过收集和SDS-PAGE 蛋白电泳确定洗脱浓度。
为了纯化不可容的含有his位点的蛋白质,(包含体),可以在变性条件下进行。利用8M尿素或者6M盐酸呱进行溶解蛋白。
样品处理:
样品要经可能溶解,避免出现堵塞现象,所以可以利用0.45uM虑膜过滤杂志
如果样品时溶解于20mM磷酸缓冲液中(含有0.5M Nacl,PH7.4),必须调整PH到7-8。
上柱前准备:
洗柱料:
1 亲柔震动胶瓶充旋胶料
2 利用吸管吸出足量柱料用以纯化目的。每毫升柱料可以吸纳5毫克蛋白
3 500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
4 小心去除上清
5 加入5倍体积去离子水,充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟,不要机械搅拌。
6 再次500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
7 再次小心去除上清
挂镍:
1 加入0.5倍柱床体积0.1M硫酸镍,充分振荡柱料。可以倒置来回5分钟,不要机械搅拌。
2500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
3小心去除上清
洗柱:
1加入5倍体积去离子水,充分振荡柱料,来回倒置5分钟
2500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
3小心去除上清
4 再洗两次柱料(一共3×5柱床去离子水)
5 最后用一倍体积起始缓冲液充旋柱料(20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4)

利用离心来纯化:
上样:
1 在起始缓冲液中加入样品,然后使整体胶浓度达到50%
2 亲柔搅拌,室温离心5-30分钟,结合能力取决于蛋白和样品浓度。
3 500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
4 取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳
洗胶:
1 加入5倍体积起始缓冲液,搅拌5分钟
2 500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
3取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳
4再洗两次柱料(一共3×5柱床起始缓冲液)。记得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白
电泳
洗柱:
1 加入2倍体积洗脱缓冲液(20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4)搅拌5分钟
2再次500g 离心2-5分钟,沉淀柱料。
3再洗四次柱料(一共5×2柱床洗脱缓冲液)。记得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳,280nM吸光值,ELISA,WESTERN
利用流速和重力纯化:
1 在柱子底部加上滤器
2 加水排气
3 加柱帽,去除残余水。推荐是最多2 Ml柱料就可以了
样品结合:
1 倒胶进入柱子
2 小心上样,用波棒室温搅拌5-30分钟
3 打开柱帽,收集流出峰用于分析
洗胶:
1 加入5倍体积起始缓冲液,收集流出液用于SDS-PAGE 蛋白电泳
2再洗两次柱料(一共3×5柱床起始缓冲液)。记得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白
电泳
洗柱:
1 加上柱帽,加入2倍体积洗脱缓冲液(20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4)搅拌5分钟。打开柱帽,收集流出峰
2再洗四次柱料(一共5×2柱床洗脱缓冲液)。记得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白电泳,280nM吸光值,ELISA,WESTERN
注意:0.5M咪唑的280nM吸光值=0.5
常见问题:
1 样品太粘稠
答:核酸存在影响,可以继续超声,加入RNA酶至10ug/mlDNA酶至5ug/ml。然后冰浴1
0-15分钟。或者也可以用注射器来回充旋。这样可以防止堵塞柱料。
2 平衡时样品洗脱了下来
答: 检查PH和缓冲液成分,如果缓冲液成分不正确,EDTA加入,强还原剂加入,都会导致这个现象出现。
加大胶的量,如果胶料承载能力过头,也绘出出现这现象。
准备新鲜的柱料,如果柱料断裂,也挂不上蛋白。
3 在洗脱液中不含有组氨酸蛋白
答:如果SDS-PAGE 蛋白电泳已经发现蛋白存在于超声液中
超声可能不完全。可以用显微镜观察超声情况。AD260/280比值。(通常是超声前将10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL,PH6-8),避免发泡以降解融合蛋白。
蛋白可能是是包含体,可以使用4-6M盐酸呱或者4-8 M尿素溶解。
尿素溶解的可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳,盐酸呱溶解的不可以进行SDS-PAGE 蛋白电泳,必须换缓冲液。
洗脱液浓度太稀,可以加大咪唑浓度或者降低PH 来决定最佳洗脱条件如果在平衡前的洗柱发现了目的蛋白,证明起始缓冲液中的咪唑浓度太高,可适当降低。
4 考马氏亮蓝或者银染发现多条带
答:加入蛋白激酶抑制剂。可能是蛋白降解。用凝血酶切割前必须去除丝氨酸蛋白酶抑制剂采用梯度咪唑来洗脱蛋白。在平衡洗脱液中加入10mM咪唑可以洗脱大量杂质而不会洗脱融合蛋白。低于500mM咪唑可以洗掉绝大部分杂质。
在洗脱步奏往起始缓冲液加入去垢剂(2%TRITON x-100或者2%Tween20)50% 葡萄糖,20mM B-巯基乙醇。记得杂质通常没有特意结合能力,可以改变缓冲液来洗脱。
如果杂志和目的蛋白有相同结合能力,那就不能用于纯化。因此可以使用别的纯化系统,例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽琼脂糖4B
柱料再生,清洁和保存
柱料再生:
1 使用0.05M EDTA,0.5M NaCl来洗脱镍离子。然后用3柱床的0.5M NaCl来洗干净EDTA
2如果是铁离子可以用0.05M EDTA泡过夜
3 这一步可以洗脱上面未能洗脱的残余结合蛋白
清洗柱料:
1 0.5倍柱床2M NaCl,反向洗脱10-15分钟
2 1M NaOH洗1小时去除残余蛋白
3 每一步都要用3倍柱床起始缓冲液清洗
4 4倍柱床70%乙醇洗脱强亲水蛋白和脂类蛋白。
也可以使用2倍柱床去垢剂。0.1-0.5%非离子去垢剂溶于0.1M乙酸。浸泡1-2小时。最后用5个柱床的70%乙醇去除去垢剂。
清洁:
1 尽可能去除微生物
2 0.5-1M NaOH反向流动半小时
3 再用3-5倍柱床消毒的起始缓冲液平衡
4 这个清洁步奏不一定能够提高纯化能力
保存:
长期保存于20%乙醇或者0.01M NaOH 于4度
【目的要求】1.掌握α1-AT分离纯化各步骤原理、操作及鉴定方法2.掌握基本技术操作及仪器使用3.熟悉人血清蛋白质的分类方法,α1-AT性质4.了解生物大分子制备技术,分离纯化类型5.学会利用学过的分离纯化方法进行基本的科研设计6.练习研究论文基本写作

【教学内容一】分段盐析法,凝胶过滤法(盐析法概念及原理,分段盐析概念,分子筛效应,柱层析基本技术)

【实验原理】1.盐析法是一种利用蛋白质在高盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将硫酸铵加入蛋白质溶液中,使蛋白质表面电荷被中和,水化膜被破坏,导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。2.通过分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。3.凝胶过滤又称分子筛层析。混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时,分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞,流速缓慢,流程长而后被洗脱,由于流速不同可以把大小不同的分子分开.

【仪器与试剂】1.离心机2.真空泵3.饱和硫酸铵溶液:称取767g固体硫酸铵,加入1000ml水中,加热使之溶解,室温冷却后4℃静置过夜,然后用氨水将pH调至中性。4.固体(NH4)2SO45.SephadexG—256.奈氏试剂7.双缩脲试剂8.pH7.4,0.05MPBS

【步骤】

一分段盐析

1.观看人血清抗胰蛋白酶(α1-AT)的分离及鉴定教学录像2.每组量取20ml血清,倒入一干净烧杯中,缓慢加入饱和硫酸铵20ml,边加边搅拌,放入4℃冰箱30分钟3.从冰箱中取出烧杯,将血清倒入离心管,3000rpm,离心20分钟4.将上清倒入一干净量筒中,记录体积后,倒入干净烧杯中,按17.6g/100ml量取固体硫酸铵,缓慢加入上清中,边加边搅拌。4℃冰箱放置30分钟5.将烧杯中液体倒入抽滤器中,负压抽滤6.刮下滤纸上的粗提蛋白,用4ml缓冲液溶解,准备加样

二凝胶过滤层析

1.凝胶柱准备:(1)连接层析柱(2)夹住出口,加入1/3体积的0.05MpH6.4PBS,灌胶,待凝胶自然沉降约1cm时,打开出口,控制流速,60滴/分(3)层析柱填装完成后,连接下口瓶,调节流速,使入口和出口流速相同。平衡至入口pH值与出口pH值相同(即pH试纸呈色相同),关闭出口,等待加样2.加样:用吸管吸去胶面以上的缓冲液,立即加入蛋白粗提液(沿管壁缓慢加入)3.打开出口,调流速15滴/分,待蛋白粗提液完全进入胶面,用少量缓冲液清洗管壁。连接下口瓶4.检测:用双缩脲试剂检测洗脱液。待试剂变红,开始收集,直到试剂不变色停止收集。测量并记录收集液的体积,留取1ml样品(标记为G—25样品),放入一冷冻管中冰箱冻存;剩余的液体收集入一大试管中,作好标记,下次实验用5.洗去铵盐:全速洗脱,用奈氏试剂检测洗脱液,直到橙色消失为止,回收凝胶

【注意事项】1.盐析所用器皿一定要干燥2.盐析时,应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中,且边加边搅拌3.层析柱上方要留有少量液体,避免使凝胶暴露于空气中4.凝胶过滤上样时,使样品沿管壁缓缓流下,勿冲破胶面

(信息提供:探生网生物医药)
只要求定性它在蛋白中存在,已经知道kda,但是提纯比较困难。
我有些问题向各位请教:
①在用超滤白蛋白,IgG中硫酸铵盐时,膜包该如何选择?选择几个?
②如用凝胶过滤来分级纯化血清中65%硫酸铵盐析出的白蛋白和纯化33%硫酸铵盐析出的IgG,其填充介质应选择什么?其洗脱缓冲液应用什么好?

下面有些关于这方面的数据,供参考:
①牛血清白蛋白:分子量:66210;分子形状:椭圆形;分子大小:
40Å*140Å;等电点:4.7;血浆中的含量:52.0g/L。
②IgG:分子量:15300;分子形状:球状;等电点:5.8—7.3;血浆中含量:2.0g/L。
③另外,我从书上看到说:凝胶过滤在分级方法中分辨率为中等,但对脱盐效果优良;流速较低,对分级每周期约≥8小时,对脱盐仅30分钟;适用于大规模纯化的最后步骤,在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理,尤其适用于两种缓冲液交替时。
期待您的帮助,谢谢您。
抗体ProteinA纯化方法123
nkylijing2018-01-23
抗体纯化分了几种类型,根据用途决定选择哪种方法进行纯化:
1. 粗纯:将制备抗体的血清或是腹水,细胞上清,直接用盐析法进行处理,这样可以将这些物质里面的其他杂质去掉,获得蛋白的成分,但是由于是粗纯,里面会混有大量的其他蛋白,这样获得的抗体,纯度较低,用于实验中背景比较高。
2.通用型纯化:用抗体结合蛋白Protein A,Protein G或者Protein L。因为不同来源的抗体和这些抗体结合蛋白的结合能力不同,所以需要根据抗体来源选择使用哪种抗体将诶和蛋白最好。对于有一些单链抗体,则多半使用protein L来进行纯化。经过抗体结合蛋白的亲和纯化后,溶液中基本只保留了抗体的成分,其他蛋白都去掉了,抗体纯度可以比较高。相对来说,这种方法是大规模抗体制备中,用得最多的纯化方法,很多抗体公司都采用这种方法来对抗体进行纯化。
3.特异型纯化:但是有些抗体,需要纯度特别高,特异性特别好,就不能简单采用上述两种方法进行纯化了。必须要通过将抗原固定制备成特异的亲和纯化柱,再纯化抗体。这个时候得到的就全是针对一种抗原的抗体了,特异性最好。当然,由于牵涉到抗原固定等操作,成本相应是最高的。
求大神赐教,急急急!!!!在这里先谢过大家。。。
抗体纯化分了几种类型,根据用途决定选择哪种方法进行纯化:
1. 粗纯:将制备抗体的血清或是腹水,细胞上清,直接用盐析法进行处理,这样可以将这些物质里面的其他杂质去掉,获得蛋白的成分,但是由于是粗纯,里面会混有大量的其他蛋白,这样获得的抗体,纯度较低,用于实验中背景比较高。
2.通用型纯化:用抗体结合蛋白Protein A,Protein G或者Protein L。因为不同来源的抗体和这些抗体结合蛋白的结合能力不同,所以需要根据抗体来源选择使用哪种抗体将诶和蛋白最好。对于有一些单链抗体,则多半使用protein L来进行纯化。经过抗体结合蛋白的亲和纯化后,溶液中基本只保留了抗体的成分,其他蛋白都去掉了,抗体纯度可以比较高。相对来说,这种方法是大规模抗体制备中,用得最多的纯化方法,很多抗体公司都采用这种方法来对抗体进行纯化。
3.特异型纯化:但是有些抗体,需要纯度特别高,特异性特别好,就不能简单采用上述两种方法进行纯化了。必须要通过将抗原固定制备成特异的亲和纯化柱,再纯化抗体。这个时候得到的就全是针对一种抗原的抗体了,特异性最好。当然,由于牵涉到抗原固定等操作,成本相应是最高的。
我们所说的血清总蛋白,主要反映肝脏合成功能和肾病造成的蛋白丢失的情况,血清总蛋白检查结果偏高并没有什么太大的临床意义的,因为它的分类中白蛋白以及球蛋白是没有什么问题的,你可以注意休息,保持心情舒畅,饮食清淡规律即可.
用大肠杆菌表达纯化的蛋白,和人血清中这种蛋白的分子量不同,western显示血清中这种蛋白的分子量高于纯化的蛋白,请问各位这是为什么呢?如何解释呢?
因为小鼠不仅仅只是受 纯化核衣蛋白 刺激,小鼠是活体会受到其它抗原刺激而产生多种抗体。如果是在理想条件下,小鼠仅受纯化核衣蛋一种抗原刺激,那么反复注射就只会产生一种特定抗体。
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