【求助】关于荧光定量问题

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【求助】关于荧光定量问题

2021-07-25

问题描述：

小弟就要进行荧光定量试验，所以在园子里面看了很多的资料？，真是似懂非懂，出现了很多的疑问，所以恳请各位指教一下，有些可能比较弱智，请各位不要见笑！非常感谢！

1.我知道一般缺省域值是3－15个循环荧光强度的标准方差的10倍，但是为什么公式是10×SD（6－15）？那仪器的本底荧光强度是前15个循环的荧光强度就算是baseline，那么仪器中用域值分析和用baseline分析有什么不同？域值能否改动？改动后的结果对于后续的分析有什么影响？一般什么时候需要改动？
2.所谓读板温度是不是就是每一部反应后检测荧光强度的步骤？是不是可以任意设定在某一步骤？譬如变性，退火，延伸甚至自己设定一个温度？
3.在做标准曲线的时候，对于标准品的要求是不是一般要求就是待扩增的目的片断，便于以后的扩增效率可比性？是不是这个也是购买的绝对标准品进行曲线作图的缺陷之一，虽然其绝对的定量已知？
4.在相对定量时候，如果内参和目的基因在同一管中进行扩增就是内参照法?不同管就是外参照法？是不是不太赞成内参照法，因为无法预知目的基因起始浓度，从而可能导致内参扩增效率远远大于目的基因而无法使用2-△△CT方法分析？
5.融解曲线的导出是不是在反应结束以后进行？融解曲线出现主峰异常增宽是什么原因导致？我还是不明白探针法是如何得出融解曲线的，主要是原理，因为染料法就是升高温度双链解链染料脱离？
6.如果用荧光染料方法进行试验，出现引物二具体很多，那么在NTC和加入模板的溶解曲线中dimer的峰值和模板中的峰值是否重叠？

敬请指教！非常感谢！

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benjibin

用户

我试着回答一下吧。1. 那个理论依据我不是很清楚，但是一般如果稀释倍数是十的话CT值相差3.3左右。所以你从结果可以大致看出一些所以然。譬如你的稀释制备标准品比较好，应该可以达到基本上3.3的差异。然后线性分析得出的标线是可以用的。但是如果相差比较大，或者比较小，甚至之间的差异参差不齐，就相对无法用了。2. rox是荧光参比，一般只是消除管间的荧光差异。和热循环没有太大关系。3. 一般认为绝对定量不需要内参，而相对定量需要内参，而且标线法相对定量一般只要选择一个标准品就行，个人认为使用内参就行。

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zhoubinbj

用户

怎么没有人回答啊？自己顶一下！谢谢各位了！

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剩贤

用户

问题真多！！！！！！！1。荧光域值的定义确实是你说的3－15个循环荧光强度的标准方差的10倍，但是实际应用中有时是3-12，有时是5-13，还有时是6-10，这跟每次实验的初始模板浓度和本底有关。域值一般软件会自动根据本底计算的，是可以手动调整或改动的，一般在你认为软件给出的域值不能很好的反映复孔的重复性，或者你认为软件给的域值偏高不在刚刚进入指数期的地方等情况下需要手动调整。baseline一般就是去除掉本底信号，一般软件都有多种方法选择，如取背景的平均值扣除，或取最低值或最高值去除等等。2。读板温度就是检测荧光信号的那一步骤的温度。具体在哪一步读板是根据你选择荧光标记的特性有关的，SYBRGreen一般在72延伸后读板；Taqman探针可以再循环的任一步读板，但是变性阶段选择的人比较少；分子信标在退火后读板；LUX在延伸或者退火后读板等等。也可以自己设定一个温度，除非是染料法为了排除引物二聚体，一般没有必要。3。做绝对定量一般标准品最好是和待测片段同样的基因序列，这样能够像你说的保证扩增效率的可比性，比如医院做乙肝丙肝等等都有很好的商业化试剂盒，里面有制备好的标准品。但是你的基因标准品买不到的时候，也可以自己制备，但对操作要求比较高，公司不可能有那么多商业化的产品。相对定量基本没有人买商业化的标准品，都是自己做，除非穷的只剩钱了。4。2-△△CT分析方法在其原理建立时候就是基于同一管中同时扩增内参和目的基因的方法，如果仔细留意一下各大公司的早期定量软件会发现SYBRGreen染料法是不能进行2-△△CT分析的（现在的软件为了迎合市场需要就不说了），这也侧面说明这一方法是基于探针的同管扩增体系的，所以不赞成内参照法的说法是没有根据的。只不过你说的模板差异很大的情况下用2-△△CT分析方法确实是有限制的，内参一般会优先扩增，而这个时候分开两管扩增就可以解决这个问题，所以大家现在不管效率有多大差异，多数都是分开管子作的，但是孔间温度和耗材的对方应的影响自然就带入了误差。这就是智者见智了，选择适合自己的方法。5。熔解曲线一般都是在循环结束后进行。主峰异常增宽需要跑胶看一下是不是有Tm值相近的非特异条带，它们的分子量一般是可以分开的。探针法是得不到熔解曲线的，不多说了。6。这个问题比较长，不知道我理解的对不对？两个峰值只能说差不多，理论上说两个峰值应该是一样的，但是体系的差别，SYBRGreen染料的重分布问题都会导致峰值的漂移，具体问题具体分析把。勉强回答完毕，贻笑方家。

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