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Exalpha Biologicals produces and sells products for Life Science Research, including monoclonal and polyclonal antibodies, for use in immunohistochemistry, wes 查看更多>
METHOD 1:Formaldehyde preservative – 2% formaldehyde solution in protein-free phosphate-buffered saline (PBS).Prepare as follows:Add 2 g paraformaldehyde powde 查看更多>
Materials Needed20ml glass scintillation vial Small stir bar Foil Glycerol 1X PBS Pipets * P-phenylenediamine ( EMD Chemicals Inc. Cat# PX0730) Carbonate-Bicar 查看更多>
STAINING NONFILAMENTOUS ACTIN WITH VITAMIN-D BINDING PROTEINMaterials1. Gc-globulin (vitamin-D binding protein; Calbiochem 345802), prepare 2 mg/ml stock in PB 查看更多>
Fixation and Staining ParametersAntigen Fixation Fixation time AntibodyDilutionRefmicrotubules 100% MeOH 5 min @ RT DM1a1:500actin 4% Formaldehyde* 8 min @ RT 查看更多>
概述及注意事项:细胞学检查包括有细胞的涂片与染色技术,其来源先于组织切片技术,目前是较为常用的病理检查方法之一。它所运用的范围也很广泛,如女性生殖系统、食管、胃、肺、浆膜腔积液、泌尿管道、鼻咽部等部位的脱落癌细胞,以及胸、腹腔的肿块、淋巴结、乳腺、和其它组织器官的细胞 查看更多>
2021-08-14
1、 取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。2、 将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基,处理1~2小时。3、 将细胞培养液倒掉,马上加入3~4ml 0.1%胰蛋白酶,并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后,马上加入终止液终止消化,并将分裂相细胞收集 查看更多>
EM Fixation of EmbryosAdapted following advice from Andy Fire and Jim Priess1. Mount embryos on slides as if for DIC, except agar has fixative. Agarose Fixativ 查看更多>
Fixation and permeabilization protocol 5/30/91 Mike FinneyThis protocol works for all stages except dauers (which won"t open) andhypoclorite-treated eggs (whic 查看更多>
1. 细胞凋亡与白血病Activation of Apoptosis in Vivo by a Hydrocarbon-Stapled BH3 HelixSCIENCE 2004,305:1466-1470 通过对BCL-2蛋白家族BID的BH3结构域进行化学修饰,使其容易穿过细胞膜,在活体内研究其激活血癌细胞发生凋 查看更多>
contributed by Patricia TsaoThis protocol will visualize both internalized receptors that were once on the plasma membrane and receptors in the biosynthetic pa 查看更多>
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快到年关,才准备要做实时定量,但因从没做过,万一设计有误,那损失不堪设想,恳请各位高手帮我看看有没有什么问题:
我要检测的是一个巢氏PCR的终产物,那我能否用首次PCR的产物纯化,稀释后来作标准品?好象一般都认为用质粒作更好,但我想质粒片段与我样品首次PCR产物的长度不同,扩增效率是不是也有差异?而且用质粒扩增前,是不是要先把质粒酶切成线性后,才能扩?(这个问题好象有点菜)
另外,如果用荧光染料,那是用预混型试剂好,还是各配各的好?因为据说镁离子浓度对实验影响较大,如果用预混型,不是就不能调离子浓度了吗?

先谢谢各位了。
理想情况下毫无疑问应该是PCR扩增的指数期。
我想做实时荧光定量PCR,是荧光染料法,仪器是Roche公司的,做绝对定量,想自己制备目标基因标准品,如何办.请指教.
一般情况,不管荧光染料还是其他染料,只要不是活性染料和还原染料,基本上都不存在失效问题。
你的荧光染料具体是哪一种?你可以通过染色试验来决定是否有效啊?一般荧光染料染色后,都会呈现明亮的颜色,比一般同样颜色要亮的多。只要能染上、只要有亮度,就是没失效。
还可以标记细胞内的某些蛋白吧
请教各位高手,荧光分光光度法测物质的含量是否必须绘制标准曲线?如果不做标准曲线,能不能用Beer定律一类的公式来计算物质的相对含量?请做过荧光分光光度法的高手指点一下,如果有这方面的操作说明,尤其是如何计算待检物质含量的例子,能否说一下,先谢谢了。邮箱wzhnanhua@eyou.com
荧光染料是研究生物学围观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一,楼主想要详细的了解的话,可以去专业的网站上面找找看,有空的话可以去生物帮那里查看一下。我比较喜欢去那里查找资料的。这个网站蛮专业的。我记得上面有一个介绍了分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料文档,还对荧光染料的使用提出了自己的看法。你可以参考一下啊。有时间就去那儿上面( YINGG.www.bio1000.com/ )找找看啊,希望可以帮到你啊
小弟就要进行荧光定量试验,所以在园子里面看了很多的资料?,真是似懂非懂,出现了很多的疑问,所以恳请各位指教一下,有些可能比较弱智,请各位不要见笑!非常感谢!

1.我知道一般缺省域值是3-15个循环荧光强度的标准方差的10倍,但是为什么公式是10×SD(6-15)?那仪器的本底荧光强度是前15个循环的荧光强度就算是baseline,那么仪器中用域值分析和用baseline分析有什么不同?域值能否改动?改动后的结果对于后续的分析有什么影响?一般什么时候需要改动?
2.所谓读板温度是不是就是每一部反应后检测荧光强度的步骤?是不是可以任意设定在某一步骤?譬如变性,退火,延伸甚至自己设定一个温度?
3.在做标准曲线的时候,对于标准品的要求是不是一般要求就是待扩增的目的片断,便于以后的扩增效率可比性?是不是这个也是购买的绝对标准品进行曲线作图的缺陷之一,虽然其绝对的定量已知?
4.在相对定量时候,如果内参和目的基因在同一管中进行扩增就是内参照法?不同管就是外参照法?是不是不太赞成内参照法,因为无法预知目的基因起始浓度,从而可能导致内参扩增效率远远大于目的基因而无法使用2-△△CT方法分析?
5.融解曲线的导出是不是在反应结束以后进行?融解曲线出现主峰异常增宽是什么原因导致?我还是不明白探针法是如何得出融解曲线的,主要是原理,因为染料法就是升高温度双链解链染料脱离?
6.如果用荧光染料方法进行试验,出现引物二具体很多,那么在NTC和加入模板的溶解曲线中dimer的峰值和模板中的峰值是否重叠?

敬请指教!非常感谢!
各位好!
附件中是我的标准曲线结果,标准品按照10x稀释,荧光染料是SYBR,可是在荧光强度与CT值的关系图中,曲线间的行距还可以接受,但是在LOG荧光值与CT值的关系曲线中,曲线怎么那么难看呢?为什么他们之间的行距不是相等的呢?我以前做的曲线很漂亮的,这是什么原因呢?影响定量的结果吗?并且在样品中也出现这么难看的曲线,就是指数增长期曲线不平滑,是什么原因呢?

切盼高手指点!!!

standardcurve.doc(49.0k)
最近在看文献时,看到realtime-PCR做相对定量的时候,要求目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。我现在要做一些基因的相对定量,所以有几个问题想问问主任和各位高手。
1.怎么看两个反应-即目标基因和内参基因是否具有相同的扩增效率?
2.每次PCR反应的扩增情况都有差异,多次反应的扩增效率岂不是都不一样了吗?
3.如何设计才能让相对定量更可行?
由于对定量PCR的接触不多,希望各位高手多多帮助!谢谢!
1.无Ct值出现
  检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
  引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
  模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
  模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
  2.Ct值出现过晚(Ct>38)
  扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
  PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
  PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。
  3.标准曲线线性关系不佳
  加样存在误差:使得标准品不呈梯度。
  标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
  引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。
  模板中存在抑制物,或模板浓度过高
  4.负对照有信号
  引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
  引物浓度不佳:重庆新桥医院网上预约挂号www.cqxqyy.net适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
  镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒
  模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
  5.溶解曲线不止一个主峰
  引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
  引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
  镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
  模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
  6.扩增效率低
  反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
  反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
  反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
  7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?
  判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性
  如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析。
  8.扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?
  参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时,选NONE)
  模板的浓度太高或者降解
  荧光染料的降解
GFP、EGFP、RFP,最常用的就是这三种自发荧光的蛋白了,还有FLuc,RLuc,这是两种需要激发的荧光蛋白
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