SensitiveandFastDNALAMPinanEasy-to-UseMasterMixFormat
Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP):Facilitatesrunningamplificationreactionsindifficulttestenvironments,enablinguseoutsideofahigh-techlaboratory.
MasterMixFormat:Simplifiesreactionsetupandminimizesoptimizationrequiredtoproducethebestassayresults.
HighThermalStABIlity:HighlyThermostableenzyme(upto90°Cfor5min)enablespreheatingofreactionscontainingpurifiedtargetDNAwhich,dependingonthetarget,mayincreaseassaysensitivityanddecreasetimetoresults.
ElevatedLAMPReactionTemperature(68-74°C):ImprovesprimerspecificityandreducesbackgroundamplificationdependingontheDNAtarget.
Freeze-dryCompatIBLe:Enablesgenerationofroomtemperaturestabletestkitsthroughlyophilization.
Customizable:OnceprimersareoptimizedwiththeLavaLAMP™DNAMasterMix,wecanworkwithyoutogeneratecustommastermixesfurtheroptimizedforyourtargetand/ortestneeds–contactus
TheLavaLAMP™DNAMasterMixisintendedtosimplifydevelopmentandoptimizationofDNALAMP(loop-mediatedisothermalamplification)reactions.LAMPkitsarecommonlyavailableasmulti-componentkitsthatrequireoptimization(e.g.MgSO4,betaine,enzymeaswellastemperature,primerconcentration,etc.).TheLavaLAMP™DNAMasterMixgreatlysimplifiesreactionoptimizationbylimitingoptimizationtotargetspecificcomponents/conditionssuchasLAMPprimerdesign,targetconcentrationandreactiontemperature.Additionally,thismastermixisheatstableat90°Cfor≤5minutes,whichenablestheadditionofareactionpreheatingstepwhichmay,dependingonthetarget,increaseassaysensitivityanddecreasetimetoresults.Needmoreinformation?SeeourFAQs.
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Figure1.Simplifiedoverviewoftheloop-mediatedisothermalamplification(LAMP)process.Forsimplicity,4/6potentialLAMPprimersareillustrated.Theinclusionoftwoadditionalprimers,F-Loop;ForwardLoopPrimerandB-Loop;BackwardLoopPrimer,oftensignificantlyenhancesamplification.Formoreinformation,pleasevisittheEikenwebsite. |
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Figure2.IllustrationofthedifferencesinLAMPreactionsetupandpotentialoptimizationparameterswhenusingamastermixvs.acomponentkitformat.PanelAillustratesthecomponentsaddedtoaLAMPreaction(left)whenusingtheLavaLAMPDNAMasterMixandthevariousparametersthancanbeoptimized(right).PanelBalsoilllustratesreactionsetup(left)andpotentialoptimizationparameters(right)whenusingastandardLAMPcomponentkit. |
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Figure3.Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)withreal-timefluorescentdetectionofamplifiedproducts.LAMPreactionsweresetupusingtheindicatedkitsaccordingtomanufacturer’srecommendations.TargetDNA(C.difficile)atvaryinginputamounts,tcdAtargetLAMPprimers,andGreenFluorescentDye(LavaLAMPKit)wereincludedinallreactions.ReactionswererunonaCFX96ThermalCycler(Bio-Rad)atthefollowingtemperatures:LavaLAMP;68°C;otherkitsattherecommended65°Candfluorescencewasmeasuredover60minutestodeterminetheTTR.NTC=NoTargetControl. |
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Figure4.TestingthethermostabilityoftheLavaLAMP™DNAMasterMix.TwosetsoftriplicateLAMPreactionsweresetupusingtheindicatedamountsoftargetDNA(C.difficile),tcdAtargetLAMPprimers,andGreenFluorescentDye.Onesetofreactionswaspreheatedto90°Cfor5minutes,andthenallreactionswereincubatedfor60minutesonaCFX96ThermalCycler(Bio-Rad)at68°CandfluorescencewasmeasuredduringthecourseofthereactionstodeterminetheTTR.NTC=NoTargetControl. |
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Figure5.TestingtheperformanceoflyophilizedLavaLAMP™DNAMasterMix.TheLavaLAMPDNAMasterMix(12.5µL)wasaliquotedintotubesandlyophilizedusingaVirTisWizard2.0.Afteroneday,eachlyophilizedtubewasreconstitutedin12.5µLwater.ThensixreplicateLAMPreactionsperconditionweresetupusingthereconstitutedlyophilizedmastermixandthestandardLavaLAMPDNAMasterMix(Controls).TheindicatedamountsoftargetDNA(S.aureus),clfAtargetLAMPprimers,andGreenFluorescentDyewereaddedtothereactions.Allreactionswereincubatedfor60minutesinaCFX96ThermalCycler(Bio-Rad)at68°CandfluorescencewasmeasuredduringthereactionstodeterminetheTTR.NTC=NoTargetControl.
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Figure6.Analysisofdaytodayvariability.Onthreedifferentdays,sixreplicateLAMPreactionsweresetupperconditionusingtheindicatedamountsoftargetDNA(M13mp18),M13mp18targetLAMPprimers,andGreenFluorescentDye.OneachdaythereactionswererunonaCFX96ThermalCycler(Bio-Rad),amplificationwasmonitoredinreal-time,andthenresultswereanalyzedtodeterminetheTTR.NTC=NoTargetControl. |
ORDERINFORMATION
BothLavaLAMP™DNAMasterMixkitscontain:LavaLAMPDNAMasterMix,DNAPositiveControlLAMPPrimerMix,andDNAPositiveControl.TheLavaLAMPDNAMasterMixwithDyealsocontainsGreenFluorescentDyeforfluorescentdetectionofamplifiedDNA.
Licensinginformation:LucigenisafullylicensedproviderofLAMPreagentsforresearchuse.PatentsWO00/28082,WO01/34790,andWO01/77317regardingtheLAMPmethodareownedbytheEikenChemicalCo.Ltd.LavaLAMP™,OmniAmp®andBstPolymerase,ExonucleaseminusaresoldbyLucigenunderlicenseforuseinLAMPforresearchuseonly.TheproductsmaynotbeusedforLAMP-basedhumanordiagnosticpurposeswithoutobtainingalicensefromEiken.USPatent8093030forLavaLAMPandOmniAmpisownedbyLucigenCorp.
Itisthesoleresponsibilityofthebuyertoensurethatuseoftheproductdoesnotinfringethepatentrightsofthirdparties.Ifthepurchaserisnotwillingtoaccepttheseuselimitations,LucigenCorporationiswillingtoacceptreturnoftheproductforafullrefund.
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(2)操作多份样品时，应先配制反应混合液并分装，减少操作，避免污染，同时增加反应的精确度。试剂的配置和分装应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台操作。
(3)移液器和吸头需专用。由于移液器极易受气溶胶或模板核酸的污染，移液器应尽可能使用可替换或可高压处理的，吸头尽可能使用带滤芯的吸头。
(4)防止操作人员污染，使用一次性手套，EP管与吸头应一次性使用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。
(5)加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要缓慢，防止样品进入移液器内；吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(6)EP管打开应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
(7)模板核酸应密封保存，防止外溢及外来核酸的进入。
(8)设立适当的阴阳性对照及重复实验，既可验证LAMP反应的准确性，又可以协助判断扩增系统的可信性。
(9)扩增产物应妥善处理，尽量避免开盖检测，开盖极易产生气溶胶污染。本公司的试剂均采用闭管检测，有效防止污染发生。展开
为适应医疗器械监督管理工作的需要，总局组织有关单位和专家对恒温核酸扩增检测仪等22个产品的管理类别进行了界定。现通知如下：
一、作为Ⅲ类医疗器械管理的产品（1个）
恒温核酸扩增检测仪：由检测系统、加热模块、温控系统、触摸屏和随机软件组成。基于荧光检测的恒温核酸扩增检测技术，定性检测样本中的目标核酸有无扩增。分类编码：6840。
二、作为Ⅱ类医疗器械管理的产品（7个）
（一）免疫磁微粒捕获仪：由蠕动泵、管路、永磁铁及其他必要辅助器具组成。用于磁微粒免疫分析中捕获磁微粒复合物，是临床免疫磁微粒检验分析的前处理设备。分类编码：6841。
（二）精液采集器：由精液收集套、润滑剂、精液采集管、采集漏斗、袖珍剪组成。产品以无菌型式提供。临床上用于收集成年男性精液，为评价男性生育能力提供完整标本。分类编码：6841。
（三）干式血细胞微量样品测试管：由测试管体、封管器、浮子、肝素钠抗凝剂和荧光吖啶橙染料组成。用于收集末梢血样和静脉血样，临床上与干式血细胞计数仪配合使用，对样本染色、抗凝和分类。分类编码：6841。
（四）胎盘生长因子检测试剂盒（时间分辨荧光法）：由校准品、铕标示踪抗体、分析缓冲液、生物素抗体、链霉亲和素微孔板条、条形码标签等组成。用于定量测定孕妇血清中的胎盘生长因子。临床上用于辅助筛查妊娠妇女孕早期唐氏综合症风险。分类编码：6840。
（五）脂联素检测试剂盒（免疫比浊法）：由试剂1（缓冲液）和试剂2（乳胶抗体试剂）组成。用于体外定量检测人血清或血浆中脂联素浓度。临床上用于评估2型糖尿病和心血管疾病的风险。分类编码：6840。
（六）小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒（直接清除法）：由试剂（含过氧化氢酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脂酶、显色剂的缓冲液）和试剂（含过氧化物酶、酶稳定剂、显色剂的缓冲液）组成。用于体外定量检测人血清中小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量，临床上用于动脉粥样硬化的辅助诊断。分类编码：6840。
（七）尿液游离LamBDa-轻链测定试剂盒（免疫比浊法）：由定标液、试剂缓冲液和试剂（游离Lambda-轻链抗血清）组成。用于体外定量测定尿液游离Lambda-轻链浓度，临床上用于单克隆丙种球蛋白增多症的辅助诊断。分类编码：6840。
三、作为第Ⅰ类医疗器械管理的产品（13个）
（一）制片染色一体机：通常由离心模块、制片模块、染色模块、控制系统等功能模块组成。用于病理分析前对人体细胞或细菌样本进行制片及染色。分类编码：6841。
（二）细胞分离制片染色一体机：通常由控制系统、过滤器、多路阀注射泵、贮液瓶、废液瓶等组成。适用于病理分析前对人体外周血或组织样本中细胞的分离、过滤、制片和染色。分类编码：6841。
（三）试剂卡孵育器：由塑料外壳、温控模块、电器元件组成。用于特定试剂卡的孵育。分类编码：6840。
（四）细胞过滤采集器：由软管、过滤收集病变细胞装置、抽吸装置组成。用于病理分析前对人体内脱落病变细胞的采集。分类编码：6841。
（五）液基细胞和微生物处理、保存试剂：主要由细胞保存液、细胞裂解液、提取液、稀释液、消化酶、防腐剂等及必要的细胞承载或制片器具组成。用于临床检验分析前细胞或微生物的保存、运输、提取、分离、沉淀、固定、制片等。分类编码：6840。
（六）病理分析前处理试剂：主要由组织固定液、组织脱水液、透明液、清洗剂等组成。用于病理分析前组织标本的固定、梯度脱水、透明、浸蜡和包埋制片。分类编码：6840。
（七）脱蜡液：由脱蜡液、防腐液、专用水等组成。用于对样本进行染色前预处理，去除石蜡包埋组织样本上的石蜡。分类编码：6840。
（八）触发缓冲液：由0.9％的氯化钠等渗溶液组成。与血小板功能分析仪及配套检测试剂盒配套使用，用于在检测前润湿生化活性膜。分类编码：6840。
（九）流式细胞分析用鞘液：由含盐缓冲液和防腐剂组成。用于与流式技术相关的分析中对样本进行检测时形成鞘流，以利于仪器进行计数分析。分类编码：6840。
（十）流式细胞分析用溶血剂：由浓度小于2％的甲醛和浓度小于15％的甘油组成。用于快速裂解人类外周血中红细胞，维持白细胞基本形态，临床上用于流式细胞仪检测前样本处理。分类编码：6840。
（十一）抗体稀释液：由缓冲液和防腐剂组成。用于临床检验时抗血清的稀释。分类编码：6840。
（十二）溶痰剂：由次氯酸钠、表面活性剂组成。用于抗酸染色前痰标本的均质化处理，以提高阳性检出率。分类编码：6840。
（十三）精液液化剂：由菠萝蛋白酶和蔗糖组成。用于精液检查前促进液化迟缓的精液标本的液化、降低精液的粘稠度。分类编码：6840。
四、不按照医疗器械管理的产品（1个）
瓷珠菌种保存管：由表面多孔的小瓷珠、胰蛋白脉大豆肉汤、甘油和蔗糖按一定比例混合组成。用于微生物检验中菌种的保存。
自本文件发布之日起，对于不作为医疗器械管理的，如已受理尚未完成注册审批的，食品药品监管部门应按规定不予注册，相关注册申请资料予以存档。尚在有效期内的医疗器械注册证书不得继续使用。
食品药品监管总局办公厅
2015年6月11日
我做的是用锁式探针来检测dna模板的ram，探针80base，其中杂交区40base，引物分别为16、18base，连接酶选取的T4 ligase和Taq DNA ligase两种，分别对应恒温和变温情况下的扩增。水解体系为EXO I和Exo Ⅲ的混合体系，参考的外文文献，应该没什么问题。聚合酶用的是Bst DNA大片段聚合酶。
一开始选择的探针浓度为200pmol/L，扩增效果挺好，当时用的DNA模板是质粒阳性标准品，但是后来在做敏感性的时候发现条带梯度差异几乎没有，而且阴性也出带，后来就没法做敏感性和特异性验证了，实验停滞了2个月一直也没进展。
按理说RAM借助锁式探针扩增的独特方式以及水解体系的存在可以有效防止污染才对，希望大家给点建议该如何解决。
万分感谢！！！！！！！！！！
附一张以前做敏感性的图（marker为2000的DNA ladder）以做参考
