Wholegenomeamplification(WGA)withlessbiasmakingthiskitideallysuitedfornextgenerationsequencingapplications.
- Highsensitivity:Typicalyieldisgreaterthan5µgwhenstartingwith1ngofgenomicDNA.
- Reducedamplificationbiasandnoprimerartefacts:Primer-freeamplificationmethodutilizesacombinationofTthPrimPolPrimase(tosynthesizeprimers)andPhi29DNApolymerase.
- Wellsuitedfornextgenerationsequencing:TestedinIlluminaandIonTorrentNGSworkflows.
- Easyandreliable
- InsensitivetoexternalDNAcontamination
TheTruePrime™WGAKitusesarevolutionarymultipledisplacementamplificationmethodbasedonthecombinationoftherecentlydiscoveredDNAprimase“TthPrimPol”andtheextremelyprocessiveandhigh-fidelityPhi29DNApolymerasetouniformlyamplifygenomicDNAfrompurifiedstartingmaterial.TheextraordinarystranddisplacementcapacityofthePhi29DNApolymeraseallowsTthPrimPoltogeneratenewprimersonthedisplacedstrandsthatareextendedbyPhi29DNApol,resultinginexponentialisothermalDNAamplification.ThetypicalDNAyieldis>5µgfromasinglereactionusing1ngofstartingDNA.
- HowdoesTruePrime™Technologywork?
- Wholegenomeamplificationfrom6pgofhumanDNA
- Absenceofprimerartefacts
- InsensitivitytoexternalDNAcontaminants
- Excellentgenomecoverage
- Extremesensitivity
- Highyields
HowdoesTruePrime™technologywork?
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ExamplesofTruePrime™wholegenomeamplification
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Absenceofprimerartefacts
1pgofhumangenomicDNA(~1/6ofthecontentofonehuman/mammaliancell)hasbeenamplifiedusingeitherTruePrime™(TthPrimPol-basedMDA)orrandomprimedMDAreactions.Randomprimedreactionscontain20%ofsequencesthatcannotbemappedtoanyorganisminsequencedatabases.
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InsensitivitytoexternalDNAcontaminations
Duetothehighsensitivityofsinglecellwholegenomeamplificationtechniquesthereisaconsiderabledangerofcontaminatingreactionswithnon-targetderivedDNA.Wethereforerecommendtotakeextremecarewhensettingupsinglecellamplificationreactionsaslaidoutinthehandbook.However,TruePrime™usershaveauniqueadvantagehere:TruePrime™doesnotacceptnon-denaturedDNAstrandsastemplateasreADIlyasrandomprimedMDAreactions.Therefore,contaminationscominginfromtheenvironmentetc.afterthedenaturationstepwillnothaveastronginfluenceonthecompositionofyourreactionoutput.WehaveshownthisbehaviourinanexperimentwherewesimulateanexternalDNAcontaminationbydeliberatelyaddinginyeastDNAtoadenaturedhumanDNAtemplate.YeastDNAisinathousand-foldexcessoverthetargetDNA(1pghumangenomicDNA):
WhereaswithTruePrime™thevastmajorityofthesequencesobtainedaretarget-derived,randomprimedMDAshowsamajorityofcontaminant-derivedsequences.
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Excellentgenomecoverage
WehaveamplifiedandsequencedtheyeastgenomeusingTruePrime™andIlluminatechnology.Using2.5millionreadpairswecover99.4%ofthetotalyeastgenome.Shownisthecoveragewithnarrowwidthofthedistributioncurve.
Acoveragegraphofyeastchromosome7exemplifiesthemoreevencoverageobtainedbyTruePrime™MDA(middlebluelinerepresentsmeancoverage).
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TruePrimeshowsanextremesensitivity
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TruePrime™produceshighyieldsofDNAfrom1fgofinput.
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ORDERINFORMATION
EachTruePrime™WGAKitcontains:BufferD,BufferN,ReactionBuffer,dNTPs,Water,Enzyme1andEnzyme2.ThecompletemanualisavailableundertheManualtab.LucigenisanauthorizeddistributorofSygnisproductsintheUS.
TruePrime™WGAKitisintendedformolecularBIOLOGyuseonlyandinvitrouseonly.Thisproductisnotintendedfordiagnosis,preventionortreatmentofadiseaseinhumanbeingsoranimals.
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这里所说的一个碱基的差异该怎么检测？如何理解？
同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；还可以加入荧光探针（分子信标），带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由实时荧光PCR仪实时捕获，直观反映扩增循环情况。
SAT检测技术的优势
→先进的恒温扩增技术
核酸扩增在一个温度下进行（42℃），无需热循环。
→领先的RNA检测技术
SAT技术直接以病原体特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，在实际应用中更显优势意义。
→更高的检测灵敏度和准确性
SAT技术的扩增效率极高，15～30分钟即可将模板扩增109倍，检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术。扩增时间短，效率高。
→有效减少假阴性结果
SAT技术采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，有效减少假阴性结果。
→有效的解决了扩增产物的污染问题
由于扩增产物为RNA，环境中极易降解，从而大幅度提高检测结果的可靠性。
→大大降低了核酸扩增实验室的要求
(2)操作多份样品时，应先配制反应混合液并分装，减少操作，避免污染，同时增加反应的精确度。试剂的配置和分装应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台操作。
(3)移液器和吸头需专用。由于移液器极易受气溶胶或模板核酸的污染，移液器应尽可能使用可替换或可高压处理的，吸头尽可能使用带滤芯的吸头。
(4)防止操作人员污染，使用一次性手套，EP管与吸头应一次性使用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。
(5)加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要缓慢，防止样品进入移液器内；吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(6)EP管打开应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
(7)模板核酸应密封保存，防止外溢及外来核酸的进入。
(8)设立适当的阴阳性对照及重复实验，既可验证LAMP反应的准确性，又可以协助判断扩增系统的可信性。
(9)扩增产物应妥善处理，尽量避免开盖检测，开盖极易产生气溶胶污染。本公司的试剂均采用闭管检测，有效防止污染发生。展开
1．目的
学会PCR操作的基本技术。
2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。
4．试剂
5U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。
5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Senseprimer5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisenseprimer５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇
目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。
6．操作步骤
（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O32μl
10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl
25mMMgCl23μl
2.5mmol/LdNTP4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/LPrimer12μl（12.5~25pmoles）
10μmol/Lprimer22μl（12.5~25pmoles）
模板质粒1μl（1×10-3pmoles）
5U/μlTaq酶1μl（5U）
总体积50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
①94℃5min
②94℃1min
③54℃1min
④72℃1min50s
⑤goto②29times
⑥72℃10min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。
7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
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