【求助】请教pXJ41p21质粒扩增中新霉素的浓度

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2021-07-23

问题描述：

前天我做pXJ41-p21质粒扩增，所用的新霉素终浓度是60μg/ml。但经过培养过夜后，昨天下午都未出现菌落，不知是不是新霉素浓度过高？还是感受态细菌的问题？刚开始摸索，未设空白对照。请教各位高手，是何原因？
以下是质粒质粒扩增步骤：
1．取400μlLB液先置于37℃水浴30分钟
2．100μlJM109（存于-80℃）于冰上解冻
3．解冻后加入50ngDNA质粒（对照只加感受态细胞）冰浴30分钟（计时）
4．42℃水浴90秒
5．冰浴2分钟
6．加入400μlLB液
7．37℃恒温摇床200rpm摇匀1小时
8．取200μl平均分布（旋转平皿）于培养基上，倒扣培养皿37℃过夜

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dxc75

用户

1.换用卡那霉素试试。25ug/ml，应该可以的。2.把菌液稀释不同浓度凃盘，有时太浓了也不长。即37℃摇1小时后，50ul涂一个，1ul加50ul水来再另涂一个。3.用另一个已知质粒作对照，看感受态细菌是否失效。

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louise3653

用户

谢谢dxc75的精辟解答！我用的质粒是pXJ41-neo，应该用新霉素啊，为何卡那霉素也可以，在网上搜到一篇博士论文，也是pXJ41-p21，加的是氨苄青霉素100ug/ml，如果所用的是pXJ41-neo，那么以上三种霉素都可以使用了，照理说不同质粒应对应特定的抗生素啊，可否解释一下？

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dxc75

用户

我仅是猜测而已。因为没有它的图谱无法知道是何种抗生素。但在细菌中多用氨苄青霉素或卡那霉素，没有见过用新霉素的。卡那霉素与新霉素是相同的基因序列，往往在真核细胞中表现新霉素抗性而在细菌中则以抗卡那霉素表现，如Cloncetech公司的真核表达系列。也有的质粒虽在真核细胞中表达新霉素抗性但在质粒本身又加入另一个在细菌中表达的抗氨苄青霉素基因，如Invitrogen公司的pCDNA3.1和Promega公司的pCI-Neo载体等。后两者在细菌的筛选就是氨苄青霉素了。在网上查不到你的pXJ41-neo图谱。你可以试一下卡那霉素和氨苄青霉素。其实很简单，做两个胶盘，一个涂点卡那霉素另一个涂点氨苄青霉素就行了。分别加菌后培养，大量出现菌落的就是相应抗生素的。

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