These vectors provide strong miRNA expression and allow you to verify and track that expression with a fluorescent protein marker. The pmR-mCherry and pmR-ZsGreen1 Vectors couple your miRNA expression cassette to a bright red or green Living Colors fluorescent reporter, for miRNA expression you can see and select.
These vectors provide strong miRNA expression and allow you to verify and track that expression with a fluorescent protein marker. The pmR-mCherry and pmR-ZsGreen1 Vectors couple your miRNA expression cassette to a bright red or green Living Colors fluorescent reporter, for miRNA expression you can see and select.
How pmR miRNA expression vectors work
Clone your miRNA sequence into the vector’s multiple cloning site (MCS) located in the 3" untranslated region (UTR) of the fluorescent protein’s mRNA transcript. This enables both molecules to be expressed simultaneously from the vector’s strong CMV promoter.
Each vector is equipped with a powerful CMV promoter, a selectable marker, and a fluorescent protein expression cassette containing either mCherry or ZsGreen1—two of our brightest Living Colors fluorescent proteins. With these vectors, you can clone and express your favorite miRNA, and then select, sort, and/or visualize the cells in which it is expressed.
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简单来说，Off-target效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径，通过microRNA途径，其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用，而如果进入microRNA途径，只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果，这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶。 如果脱靶干扰的部分基因，正好与目的基因位于同一信号通路中，或者与目的基因的生物学功能相似，那么，如果因脱靶而干扰了其它基因，亦会造成和目的基因受到干扰后相同的细胞表型改变。而实际上，可能选择的这条shRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰，或者虽然干扰了目的基因，但是并不会引起预期的细胞表型改变。
基于以上原因，自从Off-target效应被发现并被研究者们广泛认同后，越来越多的杂志要求研究者们在投稿时需要有相应的对照来说明Off-target效应。即您需要有相关对照或者实验来说明，您所获得的实验结果，不是由于Off-target效应而产生的。向左转|向右转
这种技术，以前曾被用来研究植物和蠕虫等，但直到现在才发现它对哺乳动物细胞也有效。
如果把这个思路用于医疗，使致病的基因“沉默”下来，不就可以治好许多疾病吗？而哈佛医学院的研究人员首次用ＲＮＡ干扰使活体动物的致病基因“沉默”。美国哈佛医学院的科学家在最新一期英国《自然医学》杂志上报告说，他们已经成功地利用这种核糖核酸干扰技术治愈了实验鼠的肝炎。如果进一步证实这种技术在人体内有效，将为许多疾病和感染提供新疗法。
在研究中，科学家干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（ＦＡｓ）基因”。这种蛋白质存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序，据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了ＦＡｓ基因所导致的。
研究人员给实验鼠尾部的血管注入旨在“沉默”ＦＡｓ基因的小干扰ＲＮＡ，发现有９０％的肝细胞接收到了这种ＲＮＡ分子，ＦＡｓ蛋白质的产量变成原先的十分之一。随后，科学家给实验鼠注入大量ＦＡｓ抗体，激活细胞自杀程序，模拟实验鼠患有严重肝炎的情形。
结果，未接受ＲＮＡ干扰治疗的实验鼠有４０％在３天内死亡。而４０只接受过治疗的实验鼠有３３只活了下来，１０天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。
对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。科学家目前正在寻找把小干扰ＲＮＡ送到人体特定部位的方法，以便验证ＲＮＡ干扰技术在人体中的效果。
在此，我只是抛砖引玉，向大家简单介绍一种新的技术，希望对其感兴趣的同仁多多发表，也希望版主给予支持。
域结合到siRNA 的3’的二核苷酸突出端；一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。PAZ和PIWI两个结构域，对于siRNA和目标mRNA相互作用，从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程，是必不可少的。同时，不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。例如，在人当中，AGO2“筹划”了RISCs对于目标mRNA的切割过程；而AGO1 和AGO3则不具备这个功能。
Core RISC：是介导目标mRNA切割过程或者翻译抑制的最小的RNA-蛋白质复合物。在人和果蝇身上发现的分子量少于200kDa的RISCs可能就是core RISC的重要代表。AGO蛋白质和Core RISC密切相关。
Dicer (DCR）：是RNAase Ⅲ家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。
Holo RISC：是在果蝇中发现的有着RISC活性的最大的RNA-蛋白质复合物（80S）。Holo RISC的生物学活性牵涉到几乎所有的RISC的成员，RLC成员，和一些其他通路上的蛋白质分子。Holo RISC的存在，表明了RISC组装不是孤立的，同时还是一个有序的过程。以RISC为中心的RNAi和miRNA通路与一些其他的通路密切联系，很可能借此调控生物体的生长发育过程。
Microprocessor：一种核内的复合物，主要由Drosha和Pasha两者组成，在miRNA的生物合成中促使原始的miRNA成为miRNA前体。
MicroRNA (miRNA）：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。
RISC loading complex (RLC）：是一种促使RISC形成的复合物。RLC有方向性地调节小RNA双螺旋，为以后的RISC组装作好铺垫。siRISC loading complexes （siRLCs）在果蝇中研究最多。有研究者认为在果蝇中的siRLCs包含DCR2-R2D2异型二聚体和siRNA双螺旋；R2D2部分是非对称性的感受器，为RISC组装调整好siRNA的方向。miRISC loading complexes （miRLCs）的研究尚未报导，因为它的过程更为复杂，而且体外研究miRLCs的方法还没有建立。
RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing (RITS）：是一种组织染色质变型的复合物。RITS复合物也包含Dicer加工形成的siRNA和AGO蛋白质，通过结合到异染色质的基因池上来促使异染色质上基因的沉默。
RNA-induced silencing complex (RISC）：一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SiRNA组装siRISC，miRNA组装miRISC。RISCs（无论siRISC还是miRISC）包括两种类型：切割型和不切割型。研究表明，RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。
Slicer：在切割型RISC中的内切酶的另外一种表述方法。
Small interfering RNA (siRNA）：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。向左转|向右转
请有经验的战友指点，若可以最好能提供几篇应用动物进行RNA干扰研究的文章．
非常感谢！
⒉特异性：Elbashir等和Brummel kamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。
⒊位置效应：Holen等根据人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和 hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。
⒋竞争效应：Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。
⒌可传播性：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。向左转|向右转
近期，北京大学基础医学院鲁凤民教授课题组与许中伟、夏宁邵教授等合作，在《Theranostics》杂志上在线发表了题为“ThegRNA-miRNA-gRNAternarycassettecombiningCRISPR/Cas9withRNAiapproachstronglyinhibitshepatitisBvirusreplication”的研究论文。该研究通过模拟microRNA（miRNA）的生成过程，整合双gRNA导向的CRISPR/Cas9和RNA干扰技术，高效破坏乙型肝炎病毒（HBV）的复制模板-共价闭合环状DNA（ccCDNA），探索病毒清除新路径。北医王杰讲师、陈然和张瑞阳博士研究生为该论文的共同第一作者。
目前，我国仍有慢性HBV感染者约7800万人，慢乙肝患者约2800万人。HBV感染仍是我国病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因素。作为HBV复制模板的cccDNA，由于其半衰期相对较长，加上cccDNA池的不断补充，使得细胞核内的cccDNA持续存在、感染慢性化。目前，临床上治疗慢乙肝的常用药物为核苷（酸）类似物和长效干扰素，二者均不直接作用于cccDNA，难以有效清除病毒实现临床治愈。因此，研发直接靶向cccDNA的药物，寻找清除cccDNA的新方法和新策略，是当前慢乙肝治疗药物研发的热点。
该研究以miRNA-31为基本骨架，通过模拟其核心序列的二级结构设计HBV特异的miRNA（miR-HBV），miRNA两侧侧翼序列为特异性靶向cccDNA不同位点的引导RNA（gRNA）。如图所示，该gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联体表达体系导入细胞后，在细胞核内转录形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA长转录本，经内源的Drosha/DGCR8复合体剪切，形成2个gRNA和1个miR-HBV前体（pre-miR-HBV）。进入细胞质后，pre-miR-HBV进一步经Dicer酶剪切，形成成熟的miR-HBV。一方面双gRNA导向的CRISPR/Cas9系统通过切割并去除cccDNA的关键调控和编码序列直接破坏cccDNA，另一方面通过miR-HBV在转录后水平抑制HBV复制，进而抑制cccDNA池的补充，协同促进HBVcccDNA的清除。此外，本研究还发现，当pri-miRNA-31的侧翼序列长度为38bp时与双gRNA组成的三联体对HBV复制的抑制效率最高。
双gRNA导向的CRISPR/Cas9整合RNAi技术高效抑制HBV复制模式图
当然，该技术离临床应用尚有较远的距离。一方面如何高效和靶向性地将三联体递送到HBV感染的肝细胞内是需要攻克的一大障碍；另一方面，CRISPR/Cas9基因编辑技术的脱靶效应也有安全性之虞。然而，近年来随着Cas核酸酶的不断改造，其脱靶效应得到了有效控制，安全性大为提高。而且，随着金黄色葡萄球菌Cas9的发现，使得CRISPR/Cas9系统可以装入腺相关病毒载体中，致使该技术应用于临床的距离逐渐缩短。
总之，本研究通过gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联表达框架联合CRISPR/Cas9和RNA干扰技术高效破坏cccDNA，促进HBV清除，为慢乙肝抗病毒治疗提供了新的思路。该项研究得到国家十二五重大科技专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”项目和国家自然科学基金的支持。
论文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28839466
两方面的证据提示转座子活性的抑制与siRNA有关
① 发现蠕虫mut-7 基因参与RNAi 并且与转座子的转座抑制有关;
② 在果蝇中, 参与RNAi 的RNA 解螺旋酶Spindle-E 的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失, 同时提高了反转录转座子活性。 RNAi抵御病毒感染
在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现, sgs2/sde1基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性 。 RNAi参与异染色质的形成和维持
Hall 等研究表明,着丝粒同源重复序列和RNAi 组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核；Vople 等在敲除裂殖酵母( S. pombe) 的RNAi 途径基因( 如Argonaute 、Dicer 、RDRP) 时发现异染色质转录得到的dsRNA可以在RNAi 途径的参与下, 加工成si RNA,si RNA 募集异染色质蛋白1( HP1) , 然后靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。 RNAi参与机体的发育调控及生理代谢
RNAi 只抑制转录后的基因, 所以RNAi 在生物体发育学研究中具有优势。Chuang 等用RNAi 技术进一步证实了AG、CLV3 、AP1 、PAN 等已知功能基因在拟南芥花发育过程中的功能。在RNAi 过程中形成的RISC 复合物可根据不同情况分别利用si RNA 或stRNA 行使不同的功能, 但最终均导致特定基因沉默。向左转|向右转
