RNA干扰(RNAi)实验原理与方法
| 实验方法原理 | 当确定了靶基因上的siRNA分子作用位点以后，根据靶位点的序列可以很方便地推导得到相应的siRNA分子的正义与反义RNA链序列。它们包含19bp的互补双链区和两侧的不配对区（每侧为2个U成2个T)，在合成时用T替代U可以降低成本并可以提高siRNA分子的稳定性，利用DNA/RNA合成仪首先分别合成长为21nt的siRNA分子的正义链和反义链，然后在体外将它们退火形成双链siRNA分子。 | ||||||
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| 实验材料 | RNA单链分子 试剂、试剂盒 | 退火缓冲液核酸转染试剂DEPC处理水 仪器、耗材 | NuSieveGTG琼脂糖凝胶 实验步骤 | 一、材料与设备 1.化学合成的正义与反义RNA单链分子。 2.2X退火缓冲液（200nmol/LKAc，4mmol/LMgAc2，60mmoI/LHepes-KOHpH7.4)。 3.NuSieveGTG琼脂糖凝胶（BMA公司，www.bmaproducts.com)。 4.核酸转染试剂（如Lipofetamine2000)。 5.DEPC处理水。 二、操作方法 1.用适量经DEPC处理的无菌水分别溶解化学合成的正义与反义siRNA分子RNA链。 2.在2X退火缓冲液中分别加入适量的DEPC处理无菌水、正义与反义RNA链，使正义与反义RNA链的终浓度均为20mmol/L。 3.将上述混合液置90℃变性1min，然后置37°C温育1h，经退火形成的siRNA分子可以直接用于转染细胞，或置-20℃保存备用。siRNA双链复合物可以经过几轮冻融而不受影响，不需要经过再次变性退火处理。但是在处理siRNA分子时，建议最好将RNA溶液置冰浴中，以降低RNA水解的速率。 4.可以采用4%的NuSieveGTG琼脂糖凝胶电泳或者10%~15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来检验退火的效率。但应注意的是NuSieve琼脂糖是一种低溶点琼脂糖，因此在电泳时采用过高的电流时它会熔解。 5.将siRNA双链分子在核酸转染试剂如Lipofectaminc2000的介导下转染靶细胞，并分析它对靶基因的抑制效果。 |
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发布于 ： 2018-08-05
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