四膜虫细胞核的分离实验 实验方法
| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | 辛醇PMSF 仪器、耗材 | 搅拌机光学显微镜 实验步骤 | 1.检测所用细胞数量。 2.收获细胞前在冷环境中强力搅拌时，在所有溶液中加入蛋白酶抑制剂。 3.在培养基A中加入辛醇，混合均匀。 在培养基A中加入辛醇和PMSF，即为培养基B。 4.用吊桶式转头在250ml的圆锥离心瓶中于2℃，1500~2000g离心5分钟收获细胞。 5.快速倒出上清，搅拌松动沉淀。 6.直接在培养基B中重悬沉淀细胞。 细胞破碎 7.在冷的搅拌机中高速搅切30~60秒破碎细胞。 8.用光学显微镜检查匀浆物，载玻片上放少量匀浆物，加上甲基绿。保证小核已从其临近大核的“杯状”处被移去。 差异核片状沉淀 9.将搅拌过的细胞倒入圆锥形离心瓶中，用吊桶式转头在0~4℃于1500~2000g离心5分钟。可用50~250ml的离心瓶。 10.轻微摇动瓶，使上清表面形成的表层松动，将上清和表层倒入冷的搅切机中。 11.用少量细胞核洗涤缓冲液重悬片状沉淀，用甲基绿染色后在光学显微镜下仔细观察小量、检测大核和小核的数量。 12.将片状沉淀收集到试管中，标记为Pn。 13.高速搅切上清20秒，用较高速度离心5分钟。 14.收集上清，在细胞核洗涤缓冲液中重悬片状沉淀，按照步骤11检测细胞核。 15.重复搅切和离心，提高离心速度，分析每次的片状沉淀，直到沉淀中几乎没有大核为止。 16.当最后观察的片状沉淀中小核为大多数时，高速搅切上清20秒，用吊桶式转头在0~4℃于5000g离心5分钟。 17.收集上清，将片状沉淀悬于细胞核洗涤缓冲液中，按照步骤11检测片状沉淀。 计数分离的细胞核总数 18.集中适当的含有大核的片状沉淀；小核也同样。用细胞核洗涤缓冲液重悬核于适当的体积内。 19.用甲基绿稀释少量的大核或小核。用分光光度计计数细胞核数量，计算基于起始细胞的数目。假定生长或饥饿过程中每个细胞有一个大核和一个小核；接合过程中每个细胞的细胞核数量依赖于所处阶段有很大变化。 20.当大核和/或小核收量合适，可在0~4℃于2000g离心5分钟收获细胞核。 21.在少量细胞核洗涤缓冲液中重悬细胞核，用小离心管离心5分钟洗涤细胞核。 |
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发布于 ： 2018-08-07
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