基本方案皮肤利什曼原虫病小鼠模型

材料

寄生虫接种物，无鞭毛体或后发育期前鞭毛体（见辅助方案1〜3)

DMEM或HBSS(附录1)，不加CaCl2或MgCl2

小鼠

199完全培养基（C-M199)

测径器（游标，标度盘或数字的）

1.5mlEppendorf离心管（高压灭菌，提前称重）

1.5ml微量离心管研磨棒（聚丙烯，一次性，灭菌）

血液琼脂培养皿（见辅助方案4)

26°C，无CO2培养箱

1.将寄生虫接种物溶解于DMEM或HBSS中，配成所需浓度（IO⁵〜IO⁷)至40〜50ul。

除了遗传背景外，小鼠模型的疾病过程及结果可受寄生虫剂量、接种途径及部位、寄生虫致病力的种内差异等影响。需用特定期的寄生虫感染，以比较体内致病力。

2.浅麻醉（附录2D)或将小鼠固定（附录2C)后，足垫注射含有寄生虫的悬液（附录2E)。

3.每周或定时观察足垫肿胀情况。固定动物（不麻醉），用测径器在第五趾尖底部测量足垫宽度和厚度，以未接种足垫作为对照。结果为足垫厚度、宽度的增加值（或评分），以mm2表示。

4a.淋巴结或脾脏：接种侧腹股沟引流淋巴结或脾脏制作成单细胞悬液后（单元2.1)重悬于10mlC-M199中。

4b.足垫：表面消毒感染足垫后解剖（见辅助方案2)，取下1〜IOmg组织放入灭菌、提前称重的含有〇•3mlC-M199的Eppendorf管内，盖上盖子后翻转或轻敲管子使组织沉于底部，不使组织脱水。称重离心管后研磨组织。避免手术刀或剪刀同组织一起浸入培养基，这样会带走一定体积的溶液，造成组织称重不准确。

5.取IOOmI组织勻浆（或脾脏或淋巴结悬液）和相同体积的C-M199,进行倍比稀释，接种至灭菌的血液琼脂培养板中。密封培养皿，26°C，无CO2条件下培养7〜10d。倍比稀释可在96孔板上进行，然后转移至适当的血液琼脂培养皿内。

6.倒置显微镜下计数前鞭毛体。如果血琼脂板影响直接观察，可取少量液体于载玻片或96孔板上进行计数。计算整个淋巴结或脾脏寄生虫数量，也可计算每毫克足垫组织的寄生虫数量，即寄生虫可生长的最高稀释度/组织重量。

辅助方案1使用花生凝集素制备后发育期前鞭毛体

后发育期的前鞭毛体体外生长在种系之间明显不同，即使在同一品系内，也可受传代培养的次数及生长条件的影响。因此，动物感染所需的前鞭毛体接种物应尽可能通过纯化后发育期前鞭毛体而标准化。在L.mai〇r和L.donomnf的固定培养物中，由于后发育期前鞭毛体不被花生凝集素凝集，因此可用于鉴别和纯化后发育期前鞭毛体。

材料

寄生虫：新鲜分离或冷藏的或L•而定的无鞭毛体（见辅助方案2和3)或早期前鞭毛体（ATCC;见辅助方案3)

199完全培养基（C-M199)

DMEM或HBSS(附录1)，不加CaCl2或MgCl2

5〜10mg/ml花生凝集素（PNA;VectorLab公司）

25cm2组织培养皿

75cm2或225cm2组织培养皿（任选）

26°C，无CO2培养箱

1.在25cm2培养瓶中加入IOml的C-M199，接种0.5X10⁷〜IXlO⁷寄生虫，26°C，培
养6d

2.可选：根据所需后发育期寄生虫的数量，将上述IOml已处于对数生长的寄生虫接种到含50〜IOOmlC-M199的75cm2或225cm2组织培养瓶中，扩增培养1〜2d。

3.在装有50mlDMEM或HBSS的50ml离心管中4℃，3000g离心15min，洗涤两次。重悬于DMEM或HBSS中并计数，加少量20%(V/V)丙三醇用于保存活力，配成IXlO⁸〜2XIO⁸个细胞/ml。

4.加0.Ol体积的5〜10mg/ml花生凝集素（终浓度50〜100]ug/ml)。室温培养15〜30min。4°C，200g离心5min。收集上清后按步骤3洗涤两次。

5.以少量体积DMEM或HBSS重悬细胞，计数后配成合适浓度以供培养。

辅助方案2从足垫组织中纯化无鞭毛体

为了避免前鞭毛体异质性的问题，可以通过接种从感染组织中纯化的无鞭毛体组分。

材料

BALB/c小鼠，足垫无溃疡性损伤（见基本方案）

1,75%(V/V)碘溶液（碘附，Amsco)

70%(v/V)乙醇

PBS(附录1)包含2mmol/LEDTA和50mmol/L葡萄糖

DMEM培养基或HBSS(附录1)，不加〇3(312或MgCl2
5mg/ml二乙酸荧光素（FDA;Sigma)丙酮液（4°C稳定6个月）

20ug/ml碘化丙啶（PI;Sigma)PBS液（4°C稳定6个月）

研钵

灭菌的玻璃纤维

1.感染后4〜6周，在形成溃疡前，脱颈处死BALB/c小鼠。表面消毒足垫，浸泡足垫于1.75%碘溶液lOmin，然后浸泡足垫于70%乙醇IOmin，蒸馏水清洗。

从感染了表皮种属的无鞭毛体包括L.major、L.mexicana、L,amazonensis某些种类的L.的BALB/c小鼠的一个足垫可收集到大量的无鞭毛体（近10⁸)

2.分离皮肤和皮下损伤组织，用无菌手术刀或剪刀切除主要损伤组织。

3.在盛有小量（3〜5ml)含2mmol/LEDTA和50mmol/L葡萄糖的PBS的研钵中轻轻研磨感染组织。在显微镜下观察组织匀浆是否大多数宿主细胞破裂。

4.用装有少量无菌玻璃尼绒毛的5ml注射器过滤所得悬液。

5.4°C，200g离心IOmin去除细胞碎片。重悬无鞭毛体于50mlDMEM或HBSS中，4°C，3000g离心15min后，沉淀物用少量DMEM或HBSS(1〜5ml)重悬。

6.将5mg/ml的FDA液0•04ml加入到IOml的PBS中，制备新鲜FDA工作液。将0.1mlFDA工作液（最终2ug)和0.03ml的20ug/ml的PI(0.6ug)直接加至0.1〜1.Oml细胞中。细胞染色3min后置于白细胞计数器中。用倒置荧光显微镜检测，交替使用绿色（可见光）和红色（不可见光）过滤片观察和计数标记细胞。

7.调整浓度用于接种或冷冻保存（见辅助方案3)。

辅助方案3前鞭毛体和无鞭毛体的冷藏和复苏

材料

对数生长的利什曼原虫前鞭毛体培养物（ATCC;见辅助方案1，步骤1〜2)，或新鲜分离制备的前鞭毛体（见辅助方案2)

RPMI1640培养基，4℃和37℃。

2X冷冻保存液

70%(V/V)乙醇

C-Ml99

冷冻容器（如NalgeneMr.Frostyormicroprocessorcontrolled)，容器外层装有异丙醇预冷

75cm2灭菌组织培养瓶

1.制备新鲜分离的无鞭毛体（5XIO⁷溶于冷RPMI;见辅助方案2)或经辅助方案1(步骤1〜2)培养的新鲜无鞭毛体培养物。收集对数生长（培养2〜3d)的前鞭毛体
培养物，4°C，1500g离心10min，去上清，振动管子轻轻打碎细胞沉淀后加入冷RPMI配成5XIO⁷个细胞/ml的浓度。

2.以滴入方式加入等体积的2X冷冻保存培养基。取Iml悬液加入预先标记的冷冻管中，置冰上15min。将冷冻管转移到预冷的容器中，一70°C冰箱放置过夜后，将冷冻的寄生虫冷冻管放置液氮中保存。

3.复苏时，从液氮中取出冷冻管，立即放入37°C水浴，轻轻振荡至完全融化，70%乙醇擦拭小管表面。

4.将寄生虫悬液加入灭菌的15ml聚丙烯离心管中，加入IOml温RPMI(37°C)，以滴入方式轻轻混匀。4°C或室温，3000g离心15min，弃上清。

5.轻敲小管，重悬寄生虫于10mlC-M199,加入75cm2培养瓶中培养。解冻的无鞭毛体经过活力检测，也可直接用于感染动物（见辅助方案2)。

辅助方案4血琼脂培养板的制备

材料
兔血，去纤维蛋白（Rocklandlmmunochemicals)

NNN培养基（三N培养基：诺-尼-麦三氏细菌培养基，含琼脂、盐、兔血，用以培养黑热病病原体—译者注）

3〜5mm玻璃珠（Thomas)

43°C水浴

96孔平底培养板，灭菌，带盖

1.微波炉液化70mlNNN培养基，在水浴中降温到43°C;取30ml预温43°C的去纤维蛋白兔血与NNN培养基混合。

2.将96孔板置于倾斜70°〜80°位置，加入混合液50ul/孔，盖上盖子，pamfilm膜封口或放于加湿盒中。用前4°C可保存6〜8周。