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| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | Dulbecco’s盐溶液蔗糖核仁保存液 仪器、耗材 | Teflon-玻璃匀浆器 实验步骤 | 1.准备溶液 Dulbecco’s盐溶液： 0.136mol/LNaCl 2.6mmol/LKCl 8mmol/LNa2HPO4 1.4mmol/LKH2PO4，pH7.0 蔗糖A： 0.88mol/L蔗糖 12mmol/LMgCl2 10mmol/LTris(pH7.5) 蔗糖B： 0.88mol/L蔗糖 1mmol/LMgCl2 10mmol/LTris(pH7.5) 0.1moI/LPMSF异丙醇溶液 核仁保存液： 0.88mol/L蔗糖 1mmol/LMgCl2 10mmol/LTris，50%(v/v)甘油，pH7.5 制备时先加入所有成分溶解。用H2O调至900ml。最后用HCl调pH为7.5，加H2O至终体积为1L。 2.离心收获细胞，用Dulbeccc’s盐溶液清洗3次。 3.振荡或用宽松结合的Teflon-玻璃匀浆器匀浆使细胞重悬浮于蔗糖A溶液中。 4.重悬液用RC-3离心机，HG-41转头1000g(2000r/min)离心10分钟（也可用其他厂家的相应的离心机和转头）。 5.用2倍体积的蔗糖溶液A重悬浮细胞，超声处理。 6.处理后的细胞在4℃，1200g离心20分钟。 7.吸去上清，留下松散和坚固的沉淀，用蔗糖溶液B重悬浮。 8.细胞核染色质和核仁进行3~6个循环的声波处理。 9.处理后的悬液在1200g离心20分钟。 10.通过温和的摇晃，吹打或用宽松结合的玻璃匀浆器重悬浮核仁。 11.确定产量，用适当体积的核仁保存液重悬浮核仁。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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