完整蛋白质从 SDSPAGE 胶中的电洗脱及其 MALDITOF MS 分析 实验...
| 试剂、试剂盒 | 电泳缓冲液蛋白质染色液微量离心管 仪器、耗材 | 水平凝胶电泳仪器电洗脱试剂盒真空离心浓缩仪 实验步骤 | 3.1蛋白质检测 一般而言，凝胶染色和脱色非常易于操作。在本实验方法中，我们使用ElectroBlue染料代替有固定作用的考马斯亮蓝染色液显色蛋白质（见注释1)。  (1)SDS-PAGE电泳后，用300mlMilli-Q水或去离子水漂洗凝胶（8cmX10cm)3次，每次10min。 (2)用ElectroBlue染料给凝胶染色，用大约20ml染色液浸泡凝胶（8cmX10cm)，缓慢摇动2h(见注释3)。 (3)用300mLMilli-Q水或去离子水漂洗凝胶脱色，直至达到所需的凝胶背景。每30min换一次水。 3.2电洗脱 (1)将电洗脱管垂直向上放置，加入0.8mlMilli-Q水或去离子水，盖上盖。等待10min并检查是否漏液。倒空管内液体（见注释4)。 (2)用一个干净，锋利的直刃剃刀将蛋白质条带从染色的凝胶上切下来，用一字镊子将凝胶碎片转移至电洗脱管中，在管中加入1X电泳缓冲液（0.8ml)，轻轻盖上盖，小心地将管安放在电洗脱仪的支持盘上，这样电流就可以直接通过两个薄膜窗（见注释5)。 (3)向电泳槽内灌入1X电泳缓冲液并将电洗脱支持盘放入槽内，确保电洗脱管完全浸泡在电泳缓冲液中，而且每根管的薄膜与电场垂直。 (4)120V电泳洗2h（见注释6)。 (5)电泳结束后，翻转正负极，并在相同电压下电泳30~60s(见注释7)。 (6)用镊子将凝胶碎片从电洗脱管中取出。轻轻盖上盖，将管子放回支持盘中。 (7)将支持盘放入盛有所需缓冲液或酸化水（1%蚁酸）的2L烧杯中。4°C过夜透析，期间更换一次缓冲液。 (8)透析完成后，将蛋白质溶液转移至1.5mL微量离心管中，用真空离心浓缩仪(SpeedVac)浓缩至5μL左右（见注释8)。 (9)将浓缩后的蛋白质溶液（1μl)与基质溶液（1μl，芥子酸，10mg/ml溶于30%乙腈）混合在150μl微量离心管中，盖紧盖后4°C放置过夜，让蛋白质和基质共结晶（见注释9)。 (10)轻轻打开微量离心管盖并用2μl移液器除去上清液。向管中加入1μl基质溶液以重悬晶体，涡旋振荡，然后将其点样在MALDI样品板上（见注释10)。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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