一、材料

1细胞培养和裂解

（1）小鼠脑垂体AtT20和AtT20(proSAAS)细胞系。AtT20.(proSAAS)细胞系通过用包含一个新霉素抗性基因的proSAAS表达载体转染AtT20细胞，再利用该基因对细胞毒性药物G418的抗性挑选阳性细胞得到（11)。

（2）含有10%胎牛血清（WisentInc.，Quebec,Canada)和30pg/mL硫酸双生霉素的DMEM培养基（Gibco/BLR,Grandlsland,NY)，含或不含500pg/mL的G418(Gibco/BLR)。

（3）磷酸盐缓冲盐溶液（PBS):1.35mol/L的NaCU28mmol/L的KC1，80mmol/L的Na2HPO4•7H20，15mmol/L的KH2PO4，pH7.2。

（4）Versine:含0.Immol/LEDTA的PBS。

（5）缓冲液B:10mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)-KOH，pH7.4，10mmol/LKC1,I.5mmol/LMgCl2，0.5mmol,』LEGTA钠，Immol/L二硫苏
糖醇（DTT)。

（6）蛋白酶抑制剂（PIC)片剂（RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany):一片溶于10mL缓冲液B

（7）Corning细胞刮刀（Sigma-Aldrich,StLouise,MO)。

（8）注射器（3mL)和针头（26目）。

（9）蛋白质浓度测定试剂盒（Bio-Rad,Hercules,CA)。

2双向凝胶电泳

（1）IPGphor胶条槽，18cm(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。

（2）IPGphor等电聚焦系统（AmershamBiosciences)。

（3）HoefferDALT电泳系统（AmershamBiosciences)。

（4）pH4〜7L的固相pH梯度（IPG)胶条，18cm(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)。保存于一20°C。

（5）水化上样缓冲液（RB):7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS,1%DTT

（6）BiaLyte3/10两性电解质（Bio^Rad)。保存于4°C。

（7）矿物油（Bio——Rad)。

（8）IPG胶条平衡缓冲液（EBl):50mmol/LTris-HCl，pH8.8,6mol/L尿素，30%(V/V)甘油，2%十二烷基磺酸钠（SDS)，1%DTT,1X10-4%溴酚蓝。

（9）IPG胶条平衡缓冲液（EB2):50mmol/LTris-HCl,pH8.8,6mol/L尿素，30%(V/V)甘油，2%SDS，4%碘乙酰胺，1X10-4%溴酚蓝。

（10）甲叉双丙烯酰胺溶液（30_8%T)(神经毒，戴手套!）：30%丙烯酰胺，0.8%
甲叉丙烯酰胺。保存于4°C。

（11）10%SDS。

（12）10%过硫酸胺。

（13）四甲基乙二胺（TEMED，BitRad)。

（14）SDS电泳缓冲液：25mmol/LTris,192mmol/L甘氨酸，0.1%SDS。

（15）低熔点琼脂糖（LMT)(Gibco/BLR)。通过微波炉加热溶解1%LMT至SDS电泳缓冲液中。在使用前保持50°C。

（16）银染溶液：a固定液：30%乙醇，5%乙酸；b敏化液：0.02%硫代硫酸钠；c银染试剂：0.2%硝酸银。d显影液：4%碳酸钾，0.025%甲醛(37%);e停显试剂：4%Tris碱，2%乙酸。

（17）UmaxPowerlook1100扫描仪（UmaxTechnologies,Dallas,TX)。

3基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS)

（1）胰蛋白酶（cat.no.V5111，Promega,MADIson，WI)。

（2）ZipTip(：18移液吸头（Millipore，Bedford,MA)。

（3）基质溶液：10mg/mL的a-氰-4-羟基肉桂酸溶于含〇.1%三氟乙酸的50%乙腈。

（4）VoyagerDETm-PRO基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF)(PerSeptiveBiosystems,Framingham,MA)。

（5）MALDI板（PerSeptiveBiosystems，Framingham,MA)。

4免疫印迹

（1）硝酸纤维素膜（Bio-Rad)。

（2）Towbin缓冲液：25mmol/LTris,192mmol/L甘氨酸，0.1%SDS，20%(V/V)甲醇。

（3）IXTris缓冲盐溶液（1XTBS):10mmol/LTris-.HCl，pH8_0，150mmol/LNaCl

（4）TBS——T:IXTBS,0.1%Tween-20。

（5）5%脱脂牛奶溶液：TBS^T,5%脱脂牛奶。

（6）ECL™抗兔抗体，辣根过氧化物酶链接的FUb’)2片段（来自驴）（AmershamBiosciences)„

（7）WesternLightning化学发光试剂（Perkinelmer,Boston,MA)。

二、方法

1样本制备

（1）将AtT20和AtT20(proSAAS)细胞用150mm的培养皿培养（每种细胞3盘），加人DMEM，在37°C，5%C02-95%空气的润湿环境中生长至满。AtT20(proSAAS)的培养基添加了500fxg/mL的G418。

（2）每次用10mL的PBS漂洗单层细胞3次。

（3）用Versine覆盖细胞；用细胞刮刀将细胞从板上刮下，将细胞悬液转移到离心管中。

（4）4°C1300g离心5min沉淀细胞。移出并丢弃上清液。

（5）如上所述再次离心来移去残留的Versine。

（6）用0.5mL的含PIC的缓冲液B重悬细胞，用带有26目针头的注射器推拉30次来破裂细胞。

（7）将裂解产物4°C,IOOOg离心7min。将上清液转移到新管子中并丢弃沉淀。

（8）4°C下l〇V离心上清30min，将上清液（细胞质成分）转移到新的管子中并保
留沉淀（微粒体成分)。

（9）加3倍体积的丙酮到每份细胞质成分中并置于一20°Clh，沉淀蛋白质。4°C下15800g离心15min。弃去上清液，保留沉淀。

（10）用超声处理法将每份细胞质沉淀或微粒体蛋白溶于500的RB中（见注释1)

（11）使用Bio——Rad蛋白质浓度测定试剂盒，Bradford法确定蛋白质浓度。

2双向电泳

2.1等电聚焦（IEF)

2.2十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝肢电泳（SDS^PAGE)

3银染（19)

3.1银染（见注释7)

以下步骤在振荡中进行。
(1)将凝胶浸在固定液中30min。

(2)更换固定液再振荡30min。

(3)用水漂洗凝胶5次，每次5min。

(4)在敏化液中孵育凝胶lmin。

(5)用水漂洗凝胶2次，每次lmin。

(6)在银染试剂中孵育凝胶30min。

(7)用水漂洗凝胶2次，每次lmin。

（8）在显影液中孵育凝胶直到蛋白质斑点出现。

（9）用停显试剂终止显影30min。

（10）用水漂洗凝胶3次，每次5min。

3.22D图像获取

银染凝胶在UmaxPowerlook1100扫描仪（图1)上扫描，保存数子图像。

4银染胶脱色（20)

（1）切取感兴趣的凝胶斑点。

（2）按1:1的比例混合30mmol/L的铁氰化钾和100mmol/L的硫代硫酸納。

（3）用100uL以上溶液覆盖凝胶片。

（4）室温下振荡直到银染去除。

（5）每次用500uL水漂洗凝胶片，并更换水数次直到黄色试剂去除。

（6）在200uL200mmol/L的碳酸氢氨中孵育凝胶片20min并振荡。

（7）用500水漂洗凝胶片2次，每次lmin。

（8）离心并除去水。

5胰酶消化（21，22)

(1)将凝胶片在200uLCH3CN中孵育10min。

(2)离心并除去CH3CN。

(3)SpeedVac真空离心蒸发浓缩凝胶片15min。

(4)56°C下在100)nL100mmol/LNH4HCO3,10mmol/LDTT中孵育凝胶片45min

(5)离心并除去DTT溶液

(6)加100100mmol/LNH4HCO3，55mpol/L碘乙酰胺，并在室温下黑暗中孵育30min。

(7）离心并除去碘乙酰胺溶液。

(8)在100100mmol/LNH4HCO3中振荡漂洗凝胶片lOmin。

(9)离心并除去NH4HCCV溶液。

(10)室温下在100pLCH3CN中脱水凝胶片5min。

(11)离心并除去CH3CN

(12)在100uL100mmol/LNH4HCO3中振荡漂洗凝胶片5min。

(13)离心并除去NH4HCO3溶液。

(14)室温下在100uLCH3CN中脱水凝胶片5min。

(15)离心并除去CH3CN。

(16)SpeedVac真空离心蒸发浓缩凝胶片15min。

(17)在冰上用20含500ng胰酶的50mmol/LNH4HCO3泡胀凝胶片30min。

(18)去除残留的胰酶溶液，并加50mmol/L无胰酶的NH4HCO3覆盖凝胶片。

(19)37°C下消化凝胶中的蛋白质过夜。

(20)离心并将上清转移到新會子中。

(21)加50uL50%CH3CN,0.1%三氟乙酸到凝胶片上并在冷水浴中超声处理3min。

(22)离心并转移上清到最初的上清中。

(23)再重复步骤21和22两次。

(24）SpeedVac真空离心蒸发浓缩上清液直到体积小于10uL。

(25）加0.1%三氟乙酸至10uL。

6胰蛋白酶肽段MALDI-TOF质谱分析

（1）在MALDI-TOF分析之前，按照制造商说明书用ZipTipC18移液吸头纯化胰蛋白酶消化的肽段。

（2）将纯化的肽段用2uL基质点在MALDI板上。

（3）用以下仪器设定采用延迟提取和反射模式进行质谱分析：20kV加速电压，150ns延迟时间，70%栅极电压，0.05%导向线电压，128激光发射，激光强度2000,质量门从800到2800。m/z842.51和m/z1045.56的胰酶自降解产物用于内部质量校准（图2)。

（4）选择单同位素峰的质量，通过使用搜索引擎PeptIdent(http://www.expasy.ch/tools/peptident.html)搜索Swiss-Prot和TrEMBL数据库，与相应理论质量匹配在50ppm®之内来鉴定蛋白质。

72D免疫印迹

（1）如3.2所述重复制备2D凝胶。

（2）根据制造商用户手册，在含Towbm缓冲液的HoeferSE600槽中将蛋白质点从未染色的凝胶上转移到硝酸纤维素膜上。

（3）用5%脱脂牛奶溶液封闭膜。

（4）室温下将膜在含抗-EphA2—抗的5¼脱脂牛奶中孵育lh。

（5）在TBS”T中漂洗膜4次，每次5min。

（6）在含HRP-结合的驴抗兔IgG的抗体的脱脂牛奶溶液中孵育膜lh。

（7）在TBST中漂洗膜4次，每次5min。

（8）根据制造商方案，用WesternLightning化学发光试剂显示免疫反应斑点（图3)。