材料与设备

免疫亲和介质（带固定化的MAbNT73;见下文)

溴化氰（CNBr)活化的Sepharose4B(SigmaChemicalCo.C9142)

HCl(1mmol/L)

55%饱和AMS沉淀物（见p.154)

Econo-柱(Bio-RadLaboratories)

SDS-PAGE电泳装置

试剂

偶联缓冲液

乙醇胺（1mol/L)

缓冲液B

LAC洗脱缓冲液

二硫苏糖醇（DTT)(0.1mol/L)

硫氰酸钾（KSCN)(2mol/L)

叠氮钠（2%)

(配方，见「试剂的配制pp.l84~189)

操作程序

免疫亲和介质的制备和保存

本操作所用的产MAb的小鼠杂交瘤是按标准方法（见Harlow和Lane,1988)制备的。MAb是用45%饱和AMS沉淀，并利用它们在pH7.0、25mmol/LNaCl条件下不能与DEAE-纤维柱结合的性质，从小鼠腹水纯化得到的。在上述条件下，许多小鼠IgGMAb可经DEAE柱流出，所得MAb制备物的纯度大于80%,已适于作免疫亲和层析（许多纯化MAb用的方法，可参见Harlow和Lane,1988)。MAb可共价偶联于经溴化氰（CNBr)活化的Sepharwse上，所用方法概述如下，亦可参见Pharmacia出版物AffinityChromatography:PrinciplesandMethods(PharmaciaLKBBiotechnology,1993)。

1)取1gCNBr活化的Sepharose4B胶（体积约3.5ml)浸泡于1mmol/LHCl溶胀并洗涤。

2)将溶于偶联缓冲液的约10mgMAb与洗涤过的Sepharose4B胶在室温下混合2h。

3)室温下将Sepharose4B胶置1md/L乙醇胺中2h,封闭胶上残存的活性基团。

4)洗去多余的蛋白质和封闭剂。在正常情况下，每毫升装柱的免疫亲和介质含2~3mg共价偶联的MAb。免疫亲和介质4°C保存于含0.02%叠氮钠的缓冲液中，以防细菌生长。

免疫亲和层析

在本实验中，用免疫亲和柱结合核心RNA聚合酶和各种结合的σ因子。由于σ^₃₂在出发细胞中是过量生产的，因此大多数核心RNA聚合酶都含有结合的σ³²（在正常情况下，σ³²可能只是RNA聚合酶的次要成分)。核心RNA聚合酶-σ³²复合物呈酸性，可用

PEI进行沉淀。

1)使用前取2ml免疫亲和介质浆状物重悬于10ml缓冲液B中洗涤。室温下1000r/min离心1~2min。离心操作必须轻缓，因为在高速下离心力会把胶压碎。重复此步操作一次。这样洗两次可除去叠氮钠和在储存时从胶上沥出的MAb。

2)将55%饱和AMS沉淀物溶于20ml缓冲液B中，室温下13000r/min离心10min,去除所有不溶物（如有沉淀，其量亦应极少)。留上清，取样（样品I)。

3)将溶解的澄清的AMS沉淀液加于沉淀的Sepharose4B胶中，室温下缓缓摇动混合30min。

方案补充实验：于0、5、15和30min时各取样品100ul。各样品立即离心，并取上清作SDS-PAGE分析，以确定蛋白质与免疫亲和介质结合需要多长时间（见p.178)。

注：与免疫亲和介质接触的必须是只含低浓度还原剂（DTT)的缓冲液，否则，免疫球蛋白G(IgG)的二硫键会被还原，从而导致IgG重链和轻链从介质上脱落。为此，我们用缓冲液B(不含DTT)。RNA聚合酶在不含DTT的缓冲液中虽能短暂存活，但应尽快将DTT回加于柱层析组分中。这很容易做到，于每个空的组分管中预置lul0.1mol/LDTT即可。去掉缓冲液B中5%的甘油；如有甘油存在，洗柱时，有些酶会因此步操作中所用MAb的多元醇应答性而从柱上洗脱下来。

4)缓缓离心，离下层析介质，弃上清（IAC穿过液)，将介质重悬于10ml缓冲液B中，再注入Bio-RadEcono柱中。

5)收集10ml穿过液（第1次洗柱)，加5ml以上缓冲液B,再收集5ml穿过液(第2次洗柱)。
注：洗涤介质和从介质上洗脱σ因子可在试管中以分批方式进行试验，加人合适的缓冲液，缓缓地混合15~30min,再将介质缓缓离心下来。尽管在分批方式中能较有效地使a32因子结合于介质及去除未结合的物质，但随后的洗涤和洗脱仍在一根柱上进行。当介质置于洗脱缓冲液中时，σ³²就会从抗体上解离下来，但必须以三维无规行走(three-dimensinalrandomwalk)的方式从100um大的Sepharose微珠中扩散出来，这需要很长时间。而σ³²—旦「走」出微珠，就会较有效地从微珠上洗脱下来，如果缓冲液在柱式(columnmode)层析中是从旁流过的话。

6)在室溫下，每次给柱加lmlIAC洗脱缓冲液，共10次，分别收集各组分于含lul0.1mol/LDTT的Eppendorf管中。将各组分（1~10管)放置于冰上，用快速蛋白质斑点印迹（Westerndotblot)或SDS凝胶电泳分析测定，以确定哪几管组分可以合并。
注：IAC洗脱缓冲液的密度大于缓冲液B中的免疫亲和介质。加入时可能会损坏柱子介质上浮！）。因此，必须在洗柱结束时让柱介质顶部略向下压紧，再极缓谩地加人第一次1-ml洗脱缓冲液（最好先加200ul,待其下沉后，再慢慢加入其余部分)。如加粘的洗脱缓冲液时柱的流速变慢，则可在柱的底部接一根6~10cm长的塑料管，以增加静水压，促使缓冲液流过柱子。

7)柱子使用后，用2mol/LKSCN(—种强的离液序列高的变性盐，它不会使抗体不可逆失活处理柱子，以去除残留的非共价结合的蛋白质。再用缓冲液B洗柱，并将其4°C保存于含0.02%叠氮钠的缓冲液B中。如柱子得到细心的清洗和保存，则可反复使用几十次。



POROS50Q阴离子交换层析（可选用）

欲获得纯度更高的核心RNA聚合酶-σ32复合物，可用50mmol/LTris(PH7.9)将IAC柱的峰组分稀释10倍，把丙二醇降至3%,NaCl浓度降至0.075mol/L。经稀释的样品还可进行离子交换层析,方法如PP.149~151所述，除用POROS50Q柱代替FOROS50S柱者外。最后合并的组分对储存缓冲液（缓冲液A+50%甘油）进行透析。如P.151所述。