牙髓干细胞的分离培养 实验方法
| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 牙髓组织 试剂、试剂盒 | 灭菌PBSAMSC培养基胶原酶中性蛋白酶免疫磁珠分选时所需试剂：含1%BSA的PBSA与DPSC反应的一抗用STRO-I(小鼠抗人MSC;IgM)CC9(小鼠抗人CD146MUC-18;IgG2a)或3G5(小鼠抗人外膜细胞；IgM) 仪器、耗材 | 羊抗小鼠IgG-结合或大鼠抗小鼠IgM-结合磁珠培养瓶和培养皿手术刀片和刀柄70μm细胞滤网非灭菌器材用于免疫磁珠分选回转式混合仪DynalMPC®-1磁分离器 实验步骤 | (a)用手术刀片将牙髓组织切成小碎片。 (b)将剪碎的组织放入胶原酶/中性蛋白酶混合溶液中（1:1)。 (c)37℃孵育30〜60min，间歇地摇匀组织/消化酶混合物。 (d)消化后，加人足够的MSC培养基，终止酶的活性。 (e)将悬液经70μm细胞滤膜过滤，去除细胞碎片，得到单细胞悬液。 (f)500g离心6min。 (g)倒掉上清液，用MSC培养基重悬细胞。然后进行免疫磁珠分选:和能与DPSC细胞反应的一抗孵育，包括STRO-I(小鼠抗人MSC;IgM),CC9(小鼠抗人CD146/MUC-18;IgG2a)，或3G5(小鼠抗人外膜细胞；IgM)，20Mg/mL,冰上孵育lh。用含1%BSA的PBSA洗两遍，600g离心6min。羊抗小鼠IgG或大鼠抗小鼠IgM结合磁珠的任意一个二抗孵育，4℃回转式混合仪40min。根据产品说明书推荐的方案，通过DyndMPC®-1磁分离器分离结合磁珠的细胞。 (h)细胞计数，按（1〜10)×103个细胞/cm2密度接种到培养瓶或皿上。 (i)在MSC培养基、37℃和5%CO2的培养箱中培养。 (j)细胞分离后7天，用PBSA洗培养瓶，更换培养基。之后可以一周两次更换培养基，直至细胞达到汇合。 注意事项 | 其他 | |
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发布于 ： 2018-08-06
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