欧米茄omega_卓越的标志
| 实验材料 | D-PBSA0.17%胰蛋白酶PET 试剂、试剂盒 | 转运培养液生长培养液含抗菌素的生长培养液手术刀和11号刀片眼科剪眼科镊2把50mm或100mm培养级Petri培养皿35mm和100mm非培养级Petri培养皿15ml锥形离心管微量加液器涂有FNCBSA的50mm培养皿 实验步骤 | 一、原代培养 1.取手术切除或早期活检组织，将组织放入转运培养液（LeibowitzL-15培养液，添加100μg/ml庆大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B），尽快送到实验室。 2.将组织移入100mm培养皿，用P-PBSA（不含Ca2+和Mg2+的DulbeccoPBSA）浸洗。 3.尽量切除结缔组织和有血液部分。如果组织标本的表面面积≥1cm2，将其切成小块。 4.将组织块放入35mm培养皿，然后加入足够0.17%胰蛋白酶液（用P-PBSA配制），覆盖组织块。在4°C条件下孵育过夜。 5.用一把镊固定组织块，用另一把镊将上皮剥离入胰蛋白酶液。 6.将组织悬液轻轻研磨几次，使细胞进一步分散。然后，将细胞悬液移入离心管。 7.用D-PBSA浸洗培养皿，然后将浸洗液加入细胞悬液。浸洗用量同步骤4组织消化的胰蛋白酶液。 8.用微吸管吸取一等份测定细胞产量。 9.在4°C条件下离心（125g），最好用制冷离心机。用生长培养液混悬细胞。 10.按要求用含抗菌索的生长培养液（生长培养液添加100μg/ml庆大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B）稀释细胞悬液，然后将细胞接种于涂有FN/C/BSA的50mm培养皿，密度为5×103个/cm2。 11.24h后换培养液，以除去细胞碎片和红细胞。 12.隔天换液。 二、传代培养 13.用D-PBSA浸洗细胞。 14.加入PET液（含有1%聚乙烯吡咯酮（PVP，40KDa）、0.5mmol/LEGTA和0.025%胰蛋白酶，用D-PBSA配制），完全覆盖细胞，如在100mm培养皿加入3ml。 15.在室温下孵育，直至细胞变圆或从培养皿去附着。在显微镜下观察细胞去附着情况，此过程一般需要1.5min。可通过加入高浓度胰蛋白酶或在37°C条件下消化提高去附着效率。 16.当大多数细胞去附着时，轻弹培养皿和用胰蛋白酶液吹打细胞，以机械性地加强去附着。 17.细胞去附着后，向培养皿加入5~10mlD-PBSA，终止胰蛋白酶的消化。 18.将细胞悬液注入离心管，轻轻研磨，以使细胞充分混悬。 19.用1ml吸管取细胞悬液，加入血细胞计数板，计数细胞。 20.计算悬液中细胞密度。 21.在4°C条件下离心（125g，5min）。 22.吸去上清液，用手指轻弹离心管，直至沉下的细胞分散。 23.加入适量生长培养液，用吸管轻轻混悬细胞，然后将细胞悬液注入培养皿。 24.将全部培养皿放入浅盘内，用手移动浅盘，并变化移动方向，从而摇动培养皿。注意保证每个培养皿中的细胞密度均匀，即摇动培养皿时集中于培养皿中心。另外，应注意将放培养皿的架平坦固定于孵育箱，孵育箱不能振动，以免细胞在贴壁过程中分布不均匀。 25.将细胞静置孵育4~24h，然后换培养液。 |
|---|
免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
发布于 ： 2018-08-10
阅读（84）
▍
相关分类
▍
相关文章
