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比如说二者都与蛋白的胺基反应,这是它们的共同点。那么前者是否可以与蛋白的巯基反应而后者不能呢?
1.凝胶阻滞实验:在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比.如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质,那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,于是朝正极移动的距离也就相应的缩短,因而在凝胶中出现滞后的条带,这就是凝胶阻滞实验的基本原理. 2.DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术.当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用,而不会产生出相应的切割分子,结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,俗称为“足迹”. 3.甲基化干扰实验(Methylation interference assay)是根据DMS(硫酸二甲酯)能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤(G)残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法. 4.Pull-down实验:拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验(binding assay in vitro),是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法.其基本原理是将某种小肽(例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等)的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组,表达为融合蛋白.分离纯化融合蛋白并与磁珠结合,使之固相化之后,再与表达目的细胞提取物混合保温适当时间,例如在4℃下保温过夜,使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合.然后回收磁珠,pull出目的片段 5.生物芯片技术是基于生物大分子间相互作用的大规模并行分析方法,使得生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程得以连续化、集成化和微型化,现已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一 6.染色体沉淀:用细菌基因组与目的蛋白孵育,然后用甲醛交联,随机断裂,然后WB分析. 7.酵母单杂交: 酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理,克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法.其理论基础是:许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成,因此可构建各种基因与AD的融合表达载体,在酵母中表达为融合蛋白时,根据报道基因的表达情况,便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白.理论上,在单杂交检测中,任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白.
染色质免疫沉淀,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照.当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起.如果你是只知道你的蛋白.染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,可是双链或者是单链,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,以及DNA的鉴定,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,用chip,DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记,染色质断裂,或核细胞抽提液,部分纯化蛋白. ChIP.同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,结果的重复性较低.具体的试剂和步骤你上网搜搜吧~自己实验室,分离复合物和非结合的探针,将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,交联反应的逆转,样品有差异.DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢,可以用emsa,只是想验证它俩的结合,利用抗原抗体的特异性识别反应,而且对结果的分析也需要有一定的经验,DNA的纯化,还是要再优化的 emsa怎么确定已知蛋白会与什么基因的启动子结合如果已知序列,可用纯化蛋白,想钓出你的基因.因为ChIP实验涉及的步骤多
大家好
我现在做关于细胞膜分子交联,然后用western检测多聚体的实验
遇到很大的困难
刚开始用真核细胞做,就发现细胞交联后提取蛋白,比未交联的细胞蛋白总量减少
后来用原核先提取蛋白做实验
发现交联终止后,做western交联的孔曝光没有条带,后来用同样的方法重新做了一次PAGE,染胶,发现蛋白不见了
为什么交联后蛋白减少或是不见了呢
我用的都是
Pierce公司的交联剂,用过EGS和BOSCOES,都有同样的问题
方法是综合说明书和一片文献上来的
到底问题出在哪里呢
请各位大侠帮帮忙
实验卡在这里进行不下去了
我快急死了
请有经验的,用过交联剂的老师,同学多多指导
万分感谢!!
戊二醛水溶液蒸气....可以控制交联的程度,,,理论上说是都可以,,主要看你想要交联的程度
Chemical cross-linking化学交联
指在光、热、高能辐射、机械力、超声波和交联剂等作用下,大分子链间通过化学键联结起来,形成网状或体形结构高分子的过程。橡胶的硫化、不饱和树脂的交联、环氧树脂的熟化等都是化学交联的例子。通过化学交联可改善聚合物的性能。如聚乙烯的化学交联可提高其强度和耐热性,又如皮革的鞣制过程是利用其蛋白质分子与甲醛作用,生成交联桥,以至失去溶解性。
明胶作为胶粘剂,其对纤维的粘合并不亚于合成树脂,其优越性在于适用期长,但其耐水性较差。为提高其耐水性,通常在明胶粘合剂中加多聚甲醛硬化交联剂,可降低明胶的水溶性,在没有改变胶原的生物降解的前提下,使得明胶分子链间形成交联键,使粘度提高,加强了凝固的结构,提高了明胶机械性能。明胶作为枯合剂,可用于砂布、砂纸的制造,此外也可用于生产胶带纸中。
明胶与干酪素都是蛋白质类,其分子结构同属氨基酸,但前者比后者价格便宜很多,而且在我国的产盆很大,因此具有代替干酪素做涂料胶粘剂的可能性。
紫外交联能证明蛋白质相互作用
在许多的细胞生命活动中,例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题.
重组DNA技术的发展,人们已分离到了许多重要的基因.现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性.为此需要:
a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件;
b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子;
这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用.
研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括:
a、凝胶阻滞实验; b、DNase 1 足迹实验;
c、甲基化干扰实验; d、体内足迹实验; f、拉下实验.
大家帮帮忙啊,还有没有用醋酸乙酯做油相制
白蛋白微球,油相和水相的体积比是多少啊
蛋白质的交联作用 :在一定条件下,蛋白质分子问可以通过其侧链上的特定基团联结在一起形成更大的分子从而使蛋白质变性,即分子交联。在氧化剂(如空气中的氧)存在的条件下,蛋白质分子可发生硫氢基与硫氢基的氧化型交联从而生成二硫键。蛋白质中的半胱氨酸易于发生这种二硫键型交联,使食物的机械强度增加,例如面粉在加水揉制成面团的过程中就发生了这样的变化。拒绝采集!在强热下,蛋白质分子可通过氨基酸残基上的羟基、氨基、羧基之间的脱水缩台而交联,而这种交联多数情况下不利于我们对食品蛋白质的消化利用。在碱性条件下,蛋白质中的半胱氨酸(胱氨酸)或羟基氨酸可发生消去反厦脱去H。s、HzO等,产生脱氢丙氨酸残基。该残基还可与赖氨酸反应.生成对人体不利的赖丙氨酸,使可利用的赖氨酸含量降低-严重降低蛋白质的营养价值。