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如果你做的事荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计，一般使用相关软件进行。

大学知识即可，不要网上摘的

肯定是tagman探针做出来的结果好，但是贵啊。
引物设计略有不一样，但都可用Primer5设计。

可能这得看你的运气了～我每次反转录三四个都没有问题的～ 因为大部分的引物序列都是一样的～所以没事～不会错配～但是并不排除发生错配的可能～ 我们就有人反转录不出来～U6都出不来～那就分开弄～我没也就是普通的反转录的酶～m-MLV矮Ace矮都。

各位大侠，本人纯属门外汉，领导安排了任务要设计新的PCR引物或者探针的检验方法，由于本人专业不是很对口，所以希望各位可以给点意见或者具体的方法,感激不尽！！！

探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广，也容易获得，但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是，将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中，经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤，才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂，有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基，所以有良好的信号放大作用，但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基，渗透性强，但信号放大作用则较差，合成的多相寡核苷酸探针，敏感性可以达到cDNA探针水平。
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同时在3´端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。
8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，
17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固红，30秒—5min；
19、双蒸水浸洗，5minX3次
20、脱水、透明、封片

PCR技术中扩增的是两引物之间的核苷酸序列，意思是采用该技术，可以大量扩增引物之间的序列，一般情况下，我们需要大量的某一基因的片段时，我们在基因的两端分别设计引物（一段一条），然后在体外，采用PCR的方法，用引物进行体外DNA复制，从而大量合成引物之间的基因。

PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

其原理为：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

引物肯定需要特异性的啊要不然你扩增出乱七八糟的条带对结果影响很大的

看引物能不能特异性扩增，你可以检查一下扩增后的熔解曲线，一般单一的峰是特异性引物，如果有双峰那就是扩出来了杂带

如果你做的事荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计，一般使用相关软件进行。

我是一个新手，最近在做多重定量PCR，要设计引物和探针。看到很多地方将探针要尽量靠近上游引物，想请教一下大家探针可不可以在下游引物所在的链上？如果可以，探针位置还是靠近上游引物吗？请各位有经验的帮忙指教一下了，非常感谢！

核心探针发射器和延伸探针发射器的区别是什么？

senseprimer5`TGGGCAGCAACAGCATCT3`Tm57.6℃GC%55.6%
anti-senseprimer5`CAAGGACCTCAAAGTCACAGC3`Tm52.4℃GC%52.4%
probe5`CTTCCGAGACACGCACATCA3`Tm59.9℃GC%55.0%,
是以mRNA序列为目的基因,欲做RT-PCR
这是我第一次合成引物和探针,因此格外小心,还请各位高手帮助看一下.谢谢!