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MikroMasch HQ Line Test Structures: PA01 and HOPG thumb
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NanoAndMore/HOPG-ZYH Calibration Standard - NanoAndMore/HOPG/ZYH/DS/1-1
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HOPG-ZYHHOPG (Highly Oriented Pyrolytic Graphite) - Mozaic Spread Value: 3.5°; Mozaic Spread Accuracy: ± 1.5°; Double Sided; Thickness: 1 or 2mm; Chip size: 10 x 10mmProduct DescriptionHighly Oriented Pyrolytic Graphite – HOPG, commonly used as a substrate for specimens to be examined in scanning probe microscopes (SPM, STM and AFM). It can also be used as a calibration specimen. HOPG consists of layered planes of carbon atoms (002) which are highly oriented with respect to each other. Available in different thickness and qualities.
General Description of HOPG.pdf
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各位大侠,本人纯属门外汉,领导安排了任务要设计新的PCR引物或者探针的检验方法,由于本人专业不是很对口,所以希望各位可以给点意见或者具体的方法,感激不尽!!!
本人在上海基康合成了一个病毒检测的引物和Taqman探针,第一次合成的引物、探针已经用完了,体系也已经都是优化好的,但用第二批合成的引物、探针时发现问题很多,首先是之前的平台都是在60W的荧光增量,而现在变成了20W,引物、探针还是按照合成单上给的信息溶解的。测了引物、探针的核酸浓度后发现,第二次合成后溶解到10μM的探针和第一次溶解成10μM的探针的核酸浓度差异较大,引物也是如此。我就按照浓度差异,换算成相同的用量进行配制,结果仍然很差,不知道怎么解释。
哪位站友遇到过这类问题,还请给个答案呐!!在此先谢了!
引物肯定需要特异性的啊要不然你扩增出乱七八糟的条带对结果影响很大的

看引物能不能特异性扩增,你可以检查一下扩增后的熔解曲线,一般单一的峰是特异性引物,如果有双峰那就是扩出来了杂带
主要看你的产物大小,如果你的PCR产物在80-250bp之间,且用的是SYBR法或有合适的探针,那还是通用的
我是一个新手,最近在做多重定量PCR,要设计引物和探针。看到很多地方将探针要尽量靠近上游引物,想请教一下大家探针可不可以在下游引物所在的链上?如果可以,探针位置还是靠近上游引物吗?请各位有经验的帮忙指教一下了,非常感谢!
实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间。同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了
关键是你稀释后的还是稀释前的,如果没稀释,只要不是在太阳下晒就没事。如果稀释过,建议试用一下。
prR的引物一般是RNA(单链),而探针是已知碱基序列的dna或rna
可以事先混合,混合液作为实时荧光用的最好还是现配现用,毕竟这是一个反应比较灵敏的实验。

上面较高的是样本曲线,下面较低的是未加样本(茎环引物和引物、探针都加入)

一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引 物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中,有下面几点需要注意:

1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!

4. 所有成分加完后,离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。
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